MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Campo claro Campo Oscuro Microscopía -Resumen Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Transmisión Barrido

Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? λ FILTRO AZUL Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = senθ n . q Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 0,5 . λ D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN

Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

Microscopio óptico

Microscopio óptico - Campo claro - imágenes Eosinofilia

Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes Microscopio óptico – Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes Treponema pallidum

Microscopio óptico – Contraste de fase Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

Microscopio óptico – Contraste de fase

Microscopio óptico – Contraste de fase Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

Permite la visualización detallada sin teñir Microscopio óptico – Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes diferencial

Microscopio óptico - Fluorescencia Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

(Green fluorescent protein) Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopía electrónica Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Estructura interna y detalles ultraestructurales Microscopía electrónica de barrido (SEM) Morfología y características de la superficie

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Bacilos en división Mitocondria 60.000x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Célula en corte transversal Piel humana

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco

Microscopía óptica vs. electrónica

Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se  torna peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

Microscopía de fuerza atómica (AFM) Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha). Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).

Microscopía de fuerza atómica (AFM) AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

Introducción a las Técnicas inmunológicas ELISA Western blot Dot blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo

Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas

Anticuerpo Antígeno Linfocito B Activación Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos) Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno

Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

Sangre Suero Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Centrifugación Suero Purificación

+ Fusión Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Antígeno Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

Para detectar Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos

ELISA Para detectar Anticuerpos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA Para detectar Antígenos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

Revelado – Detección Indirecta Complejo biotina-avidina

Revelado – Detección indirecta Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

Revelado – Detección indirecta Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos

Ventajas ELISA Muy sensible Gran número de muestras procesadas simultáneamente Resultados rápidos Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)

Incubación con Ab y revelado Western blot Western blot: identificación de proteínas SDS - PAGE Incubación con Ab y revelado Transferencia Membrana Gel Transferencia

Biotina-avidina + peroxidasa Revelado Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Biotina-avidina + peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccionar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)

Membrana nitrocelulosa Ejemplo Western blot Gel acrilamida Membrana nitrocelulosa Placas radiográficas DAT Actina 250 160 105 75 50

Dot blot Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot DOT BLOT Identificación de moléculas Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology 2003 1:6)

Inmunohistoquímica: identificación en el tejido Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado

Inmunohistoquímica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

Inmunohistoquímica - Sustratos

Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja de Acridina DAPI Bromuro de Etidio

Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD56

Inmunofluorescencia-colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

Inmunofluorescencia - colocalización

Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunophenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática etc

Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células

Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

Citometría de Flujo Columna de células

Citometría de Flujo Laser Detector

Granularidad Tamaño Citometría de Flujo La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Granularidad Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

Citometría de Flujo

Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo Ejemplo: Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides