Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular

Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Campo claro Campo Oscuro Microscopía Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Transmisión Barrido

Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? λ FILTRO AZUL Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = senθ n . q Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

¿De qué depende la resolución? Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 0,5 . λ D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN

Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

Microscopio óptico

Microscopio óptico - Campo claro Eosinofilia

Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes Microscopio óptico - Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

Microscopio óptico - Campo oscuro Treponema pallidum

Microscopio óptico - Contraste de fase Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

Microscopio óptico - Contraste de fase

Microscopio óptico - Contraste de fase Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

Permite la visualización detallada sin teñir Microscopio óptico - Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia diferencial

Microscopio óptico - Fluorescencia Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

(Green fluorescent protein) Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Bacilos en división Mitocondria 60.000x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM) Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Piel humana Célula en corte transversal

Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM) Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco

Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se  torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

Técnicas inmunológicas

Introducción a las Técnicas inmunológicas ELISA Western blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo

Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas

Anticuerpo Antígeno Linfocito B Activación Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno

Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

Sangre Suero Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales Centrifugación Suero Purificación

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

+ Fusión Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Antígeno Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

Para detectar Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA Antígenos Anticuerpos

ELISA Para detectar Anticuerpos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA Para detectar Antígenos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

ELISA Para detectar Antígenos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

ELISA

Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina

Técnicas inmunológicas - Detección indirecta Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

Western blot Western blot SDS PAGE Gel Transferencia Membrana

Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima

Inmunohistoquímica Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado

Inmunohistoquímica - Sustratos

Inmunohistoquímica - Revelado Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja de Acridina DAPI Bromuro de Etidio

Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD56

Inmunofluorescencia - colocalización La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

Inmunofluorescencia - colocalización

Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática

Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células

Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

Citometría de Flujo Columna de células

Citometría de Flujo Laser Detector

Granularidad Tamaño Citometría de Flujo La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Granularidad Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea FSC SSC Granulocitos Linfocitos Monocitos RBCs, debris, Células muertas

Intensidad de fluorescencia Citometría de Flujo - Histograma Cuentas Intensidad de fluorescencia

Citometría de Flujo - Dot Plot

Citometría de Flujo - Dot Plot

Citometría de Flujo - Cell sorting

Citometría de Flujo

Citometría de Flujo