Análisis de la expresión de marcadores asociados a linfocitos T reguladores y su correlación con variables clinicopatológicas y pronósticas en carcinomas de la cavidad oral Iryna Shukotska, Rafael Sirera, Luz García Alonso, Antoni Pla, Gracia Sarrión, Sandra Gallach, Alfonso Berrocal, Andrea Cabrera, José Vivente Bagán, Carlos Camps Hospital General Universitario Valencia SPAIN

Tumor infiltrating lymphocytes Stage IV ovarian cancer Zhang L, et al, N Engl J Med 2003

Regulatory T Lymphocytes (Treg) CTLA-4, Foxp-3, CD4, CXCR4, CD127low, CD25 (IL-2R)high IL-10, TGF- Weinberg RA, Cancer Biology, 2007

Intratumoral Balance of Treg Is Associated With Prognosis of Hepatocellular Carcinoma after Resection n=302 patients Gao Q, J Clin Oncol 2007 tissue microarrays

Quantification of Regulatory T Cells Enables the Identification of High-Risk Breast Cancer Patients overall survival relapse-free survival ER-positive tumors ER-negative tumors IHC, n=222 patients Bates GJ, J Clin Oncol 2007 stratified by the median number of Treg

HLA-G Biology Human non-classical MHC molecule Expressed in Trophoblast Supresses activity NKs CTLs Maternal tolerance to gentically different tissues Tumor cells part of the strategies to scape immunosurveyance

IHC Expression of HLA-G Correlates with Poor Prognosis in Gastric Carcinoma IHC, n=160 patients HLA-G negative (—) HLA-G positive (- - - -) Yie S, Ann Surg Oncol 2007

HLA-G Expression: a Prognostic Indicator for Patients with CCR IHC, n=201 patients HLA-G negative (—) HLA-G positive (- --) Ye S, Mod Pathol 2007

Our Cohort In 36 frozen tissue from resected oral cancer patients 16 were male; Median age 64,0 y [34-92] Patients presented squamous carcinomas of the tongue (n=21) or other localization (n=15) Stages from I to IV (stage I=4; II=9; III=4; IV=5); 6 p metastatic disease 17 patients presented well-differentiated lesions, and the other 12 moderately-poor differentiated cells. Eight patients received post-surgery chemo and radiotherapy. It was possible to determine the expression of genes in 92% of the samples.

Nuestro estudio tanslacional 36 Pacientes cáncer oral resecable Evaluación de la calidad e integridad del mRNA Extracción del mRNA del tejido tumoral y sano CTLA-4, Foxp-3, IL-10, TGF-, CD4, CD8, CXCR4 (CD127), CD25 (IL-2R) y HLA-G El proceso metodológico seguido fue el siguiente: -Se partió de un grupo de 53 pacientes con NSCLC en estadios IIIb o IV a los que se extrajo sangre periférica en el momento del diagnóstico y al 4º ciclo de tratamiento con docetaxel/cisplatino. -Se purificó el RNA empleando el PaxGene Blood RNA kit de PreAnalitix. Se escogió este sistema de purificación porque contenía un reactivo para la preservación de la degradación del RNA de RNAsas y minimiza la expresión de nuevos mensajeros ex vivo. -Seguidamente se evaluó la calidad e integridad del mRNA extraído mediante espectrofotometría y electroforesis. Tal y como se muestra en las imágenes el RNA presentaba baja contaminación por proteínas y presentaba buena integridad puesto que en el gel electroforético las bandas correspondientes al RNA ribosómico 18S y 28S están bien definidas, demostrando que las muestras son adecuadas para realizar estudios de expresión. -Se retrotranscribió el RNA a cDNA empleando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit® (Applied Biosystems) -y finalmente se cuantificaron los niveles de expresión génica mediante RTqPCR empleando los ensayos TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) para la amplificación selectiva de los genes correspondientes a los receptores del VEGF, la MMP9, CD31, CD34, CD133, CD146 y Tie1 y Tie2. Cuantificación relativa de la expresión génica RTqPCR TaqMan® Gene Expression Assay (Applied Biosystems) Relación con variables clínicas Transcripción Reversa mRNA cDNA High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit® (Applied Biosystems) 10

TILs and OS p= 0.044 p= 0.307

Correlation with tumor area CTLA-4 FOXP3 CD4 CD25 <median Mediana 2,66359 3,04232 ,82571 2,60388 Mínimo ,103 ,325 ,032 ,104 Máximo 19,837 10,845 2,259 6,660 >median ,83433 1,04936 ,24973 ,87239 ,273 ,543 ,055 ,067 5,975 4,152 ,893 5,577 p ,029 ,038 ,022 ,013 FoxP3 and metastatic disease M Median n SD 1,97262 25 1,777964 1 4,23079 6 3,393249 Mann-Whitney, p=0.046

FoxP3 and TTP TGF- and OS p= 0.023 p= 0.014 FoxP3 median 95% CI lower upper <per75 >per75 8,700 5,876 11,524 TGFB median 95% CI lower upper <per75 38,000 >per75 7,500 3,907 11,093

Treg phenotype Foxp3 & TGF- median 95% CI lower upper Both high 13,800 5,582 22,018 other NR

Treg phenotype (CD25high+CD127low) median 95% CI lower upper CD25high+CD127low 6,100 4,066 14,070 other NR

HLA-G 48% expressed HLA-G p= 0.046 median 95% CI lower upper expressed NR Not expressed 15,000 12,899 17,101

Conclusions We have been able to evaluate the presence of tumor infiltrating Treg cell populations in OSCC using RT-PCR The expression of CD4 (Th) but not CD8 (CTL), is a marker of good prognosis Gene expression of markers associated with Treg function are higher in smaller, well differentiated tumors and metastatic disease We have found that several molecules associated with Treg function act as prognostic markers Those patients with higher expression of Foxp3 and TGF-b have poorer prognosis in TTP and OS We have shown HLA-G expression in about half of the samples, and its good prognostic value