Técnicas moleculares I “Tecnología del ADN”

Estructura y características de los ácidos nucleicos mRNA

Propiedades físico-químicas de los AN

Temperatura de melting

Procariotas vs Eucariotas Genoma de un mamífera 3 Gb Genoma de E.coli 1,2 Mb

Tecnología del ADN recombinante Clivaje del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción, que facilitan el aislamiento y manipulación de genes. Hibridización de AN que hace posible detectar secuencias específicas de ADN y ARN. Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la técnica de PCR Secuenciación de los nucleótidos que componen un determinado fragmento de ADN Monitoreo de la expresión de genes en una célula mediante microarrays

Enzimas como herramientas de la tecnología del ADN

secuencias palindrómicas Clivaje de secuencias específicas del ADN: Enzimas de restricción Extremos romos En general reconocen secuencias palindrómicas Extremos cohesivos 5’ extendido 3’ extendido

Técnicas electroforéticas: separación, purificación e identificación de AN Permiten separar las moléculas de AN por tamaño. Geles de: Agarosa Poliacrilamida

Clivaje y purificación de secuencias específicas de ADN MAPA DE RESTRICCION PURIFICACIÓN DEL ADN

Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucleótido quinasa Oligonucleótidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuya secuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento

Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Southern blot

Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Northern blot

Ejemplos de Southern blot y Northern blot Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda Calle 1-9: muestras a chequear Calle L: ladder, patrón de tamaño Calle 10: control positivo Calle M: ladder, patrón de tamaño

Detección de secuencias de AN específicas: Hibridización in situ

Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado Componentes mínimos: 1- Origen de replicación 2- Gen marcador de selección 3- Sitios de restricción “polylinker”

Vectores de clonado: Plásmidos Estructura CCC y su tamaño es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb

Otros tipos de vectores Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb Cósmidos: híbrido plásmido y fago L (30-40 kb) Fásmidos: híbrido plásmido y fago M3 Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs (100-500 kb)

Transferencia de la químera de ADN a la célula huesped

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Ciclos: Desnaturalización (92-95 ºC) Hibridación (35-60 ºC) Polimerización (72 ºC) http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html

PCR : incorporación de secuencias de restricción

Digerir con ER3 plásmido y EJEMPLO: Objetivo comparar genomas y aislar gen X del jerbo. Aislar ADN genómico de ambos animales e identificar y comparar gen X en ambas especies Calle L: Ladder patrón de tamaño Calle 5, 7 y 9: controles negativo Calle 6: ADN del jerbo digerido con ER1 Calle 8: ADN del ratón digerido con ER1 Calle 10: gen X de ratón Southern blot ER1 ER2 ER2 ER1 ER2 ER3 L 3 1 2 ER3 ER3 purificación del gen Gen x jerbo + gen X + ADN ligasa ER3 PCR Ligación Digerir con ER3 plásmido y fragmento de PCR Gen x jerbo ER3 Transformar bacterias Extracción de ADN plasmídico: TECNICA DE MINIPREP Chequeo de colonias

Extracción de ADN plasmídico a partir de bacterias Introducción a los TP 1 y 2 Extracción de ADN plasmídico a partir de bacterias Miniprep- Hidrólisis alcalina Cuantificación y análisis de pureza Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa

TP nº 1: Extracción y cuantificación de DNA plasmidico