João Ernesto de Carvalho Actividad anti-cáncer de los extractos y sus compuestos activos obtenidos de productos naturales RIBECANCER Itajaí – SC - BR 26 – 28/11/2012 João Ernesto de Carvalho

Búsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncer Triage (screening) inicial en cultura de células tumorales humanas Estudios de los mecanismos de acción Modelos experimentales de cáncer en animales de laboratorio Estudios de toxicidad Estudios clínicos

Triage (screening) inicial: líneas celulares de cáncer humano Leucemia (K 562) Pulmón (NCI H460) Mama (MCF 7) Ovario con fenotipo de resistencia a múltiplos fármacos (NCI ADR) Melanoma (UACC 62) Riñón (786 0) Colon (HT 29) Ovario(OVCAR 03) Próstata (PCO 3) Glioma (U251)

Triage in vitro Inoculación placas de 96 pocillos RPMI + soro fetal bovino Incubación 24 horas Fijación ácida de la placa controle (tiempo cero) Adición de las muestras Incubación 48 horas Fijación: adición de ácido Coloración SRB Solubilización del colorante (trizma base) Densidad óptica 540 nm

Branco substância teste Contr célula Branco meio Branco substância teste 1 D1 D2 D3 2 4 5 3

Doxorrubicina

Holbeck, S.L. Update on NCI in vitro drug screen utilities European Journal of Cancer 40 (2004) 785–793

UNIVALI/RIBECANCER

de los extractos activos Colecta y Identificación Material vegetal diclorometano Material vegetal Extracto orgânico etanol 70% Teste de actividad anticâncer in vitro 5-10 mg Extracto hidroalcoólico segunda colecta Fraccionamiento de los extractos activos

De los extractos activos Extración y aislamiento Fraccionamento De los extractos activos Teste de actividad anticâncer in vitro 5-10 mg Aislamiento princípios activos Estudios agronômicos y cultivo Teste atividade antiproliferativa Identificación princípios activos Identificación princípios activos Extración y aislamiento en gran cuantidad síntesis

animales de laboratorio Testes in vivo Testes en animales de laboratorio 0,1 – 100 gramos Formulación farmacéutica Mecanismo de acción Toxicología pre-clínica Estudios clínicos Fases I, II, III e IV

EBD - Pothomorphe umbellata (Piperaceae) - pimienta Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008

Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva de sobrevida Kaplan-Meier Tumor ascitico de Ehrlich en ratones Inoculación 0,5 mL 104 celulas del tumor de Ehrlich en el abdomen de ratones Tratamientos: 40, 110 y 180dia Controle negativo: salina Controle positivo: doxorrubicina 5 mg/ kg EBD 100, 200 y 400 mg/ kg ip. via Pós-inoculación n=10 Numero y fechas de las muertes ANOVA y curva de sobrevida Kaplan-Meier Sacoman et al. Braz. J. Medical Biological Res. 41: 411, 2008

Tumor ascítico de Ehrlich: curva de sobrevida

Tumor sólido Ehrlich en ratones Las celulas del tumor de Ehrlich son inoculadas en la pata Evaluación: medida del volumen de la pata peso relativo del tumor analises histológicas aumento de peso de los animales

Pletismometro: determinación del volumen tumoral 16

Tumor sólido de Ehrlich en ratones Dosis de 30 mg/kg  inibición de crecimiento

Metástasis pulmonar inducida pela linaje B16-F10 (melanoma)

Fibra semipermeable (Hollow-fiber) - Encapsulamiento de la linaje tumoral y incubación por 24 horas Implante de las fibras en ratones Balb-C, tejido subcutáneo dorsal y abdomen Tratamientos - Sacrificio en el 14º. día para evaluación de la viabilidad celular por MTT

Fibra semipermeable: tejido subcutáneo dorsal y abdomen

Hollow-Fiber – K. coriacea (Fr7) Hollow-fiber: abdomen

Hollow-Fiber model – K. coriacea (Fr7) Hollow-fiber: subcutáneo dorsal

Metodologías en desarrollo Tumor xenográfico Citometria de flujo

João Ernesto de Carvalho Divisão de Farmacologia e Toxicologia Gracias João Ernesto de Carvalho Divisão de Farmacologia e Toxicologia CPQBA – Unicamp carvalho@cpqba.unicamp.br