DOCENTE DRA TELMA BRICH INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD FUNDACIÓN HÉCTOR A. BARCELÓ CARRERA DE TÉCNICOS EN ANÁLISIS CLÍNICOS ASIGNATURA: ANÁLISIS CLÍNICOS II ENZIMOINMUNOENSAYOS DOCENTE DRA TELMA BRICH

*Respuesta celular. Se apoya en la capacidad fagocítica de diversas células del organismo. En este tipo de respuesta intervienen los linfocitos T(derivados del timo) y los macrófagos. Emiten pseudópodos en contacto con partículas extrañas y las engloban en su protoplasma. Los linfocitos T actúan de 3 formas: 1) Transformándose en linfocitos citotóxicos o asesinos, que destruyen antígenos como células cancerosas o células de tejidos trasplantados. 2) Sintetizando el factor activador de los macrófagos (por el que éstos se activan y adquieren la propiedad de fagocitar antígenos como bacterias, protozoos o virus, y digerirlos). 3) Sintetizando el interferón: proteína que induce la síntesis de proteínas antivirales en células infectadas por virus (aunque esto forma parte más bien de la respuesta humoral). Una vez sensibilizados, se distinguen tres clases de linfocitos T según su función: los linfocitos citotóxicos (Tc), que al tomar contacto con el antígeno para el que han sido sensibilizados, lo destruyen; los linfocitos Th, que activan la respuesta inmune; y los linfocitos Ts, que inhiben la respuesta inmune. *Respuesta humoral. Se caracteriza porque los linfocitos B, al ser estimulados por el antígeno, reaccionan formando anticuerpos. En la formación de anticuerpos, sin embargo, intervienen 3 tipos de células: los linfocitos B, los linfocitos T y los macrófagos. Los macrófagos tienen la función de fagocitar los antígenos y procesarlos de tal manera que se conviertan en antígenos aptos para estimular la respuesta inmunológica cuando son presentados a los linfocitos. Los anticuerpos reaccionan específicamente con los antígenos para bloquear su acción nociva para el organismo.   Resumiendo: -Respuesta celular: linfocitos T y macrófagos. -Respuesta humoral: linfocitos B con la colaboración de linfocitos T y macrófagos.

Antígeno:molécula que al entrar en contacto con los linfocitos es capaz de activarlos y desencadenar una respuesta de tipo humoral o celular. Anticuerpo: glicoproteínas de alto peso molecular sintetizadas por las células plasmáticas y secretadas al espacio extracelular Hapenos: sustancia química de pequeño peso molecular que no induce por sí misma la formación de anticuerpos pero al unirse a una proteína transportadora como la albúmina produce una respuesta inmune.

Anticuerpos: Estructura/ regiones

Anticuerpos: Dímero/ Pentámero

Respuesta inmune 1º y 2º

Interacción Ag-Ac Reversible . Alta especificidad . Enlaces no-covalentes entre el determinante antigénico y el sitio activo del Ac. Interacción Primaria. Interacción secundaria.

Anticuerpos monoclonales

Técnicas inmunológicas Alta especificidad Sensibilidad Estabilidad Versatilidad en el diseño del ensayo: Elisa, Inmunofluorescencia, Western blot. Tiempo de ejecución, infraestructura y costo razonable. g mg ug ng pg f g 1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15

Metodología Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través de una reacción secundaria (precipitación o aglutinación) y son más económicas y sencillas que aquellas que permiten visualizar la interacción primaria (Técnicas con inmunomarcación) INMUNOENSAYOS DIRECTOS. Medida directa del complejo Ag-Ac. INMUNOENSAYOS CON REACTIVOS MARCADOS O INDIRECTOS Requieren el uso de material marcado o SONDA para medir la concentración de antígeno o anticuerpo presente en la muestra.

Inmunoensayos directos Reacciones de precipitación

Para que se pueda producir la interacción secundaria Ag-Ag con la consecuente formación del precipitado, tanto el Ag como el Ac deben ser bivalentes. Ac BIVALENTE Ag MONOVALENTE Ac BIVALENTE Ag MULTIVALENTE FORMACION DE CI PRECIPITANTE EL Ag PUEDE TENER UN SOLO EPITOPE REPETIDO O VARIOS DISTINTOS

Inmunoensayo de precipitación: Inmunodifusión radial -IDR

IDR

Inmunoensayo de precipitación: Inmunoelectroforesis

Inmunoensayo de precipitación: Turbidimetría- Nefelometría Se forman inmunocomplejos (CI) insolubles al igual que los ensayos de precipitación, pero quedan en suspensión en la mezcla de reacción.

Nefelometría : Mayor sensibilidad / No automatización Turbidimetría: Se aumenta la sensibilidad adosando al Ac una partícula de látex

Reacciones de aglutinación Las reacciones de aglutinación involucran una interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza macroscópicamente como grumos. En las reacciones de aglutinación el Ag es particulado. Sencillas Rápidas Reacciones de aglutinación activas Reacciones de aglutinación pasivas Ag soluble + Partículas (GR-Látex)→ Ag Particulado

Reacciones de aglutinación activa se basan en el empleo de la partícula aglutinante como antígeno. Ejemplos : Determinación de grupo y factor Reacción de Huddleson. (Antígenos febriles) Reacción para Salmonella. Coombs directa e indirecta en tubo.  

Floculación

Grupo sanguíneo y factor Rh Prueba cualitativa para la determinación del grupo ABO y Rh. El tipo sanguíneo dependerá del Ag presente en la superficie del GR y el suero del paciente. Los Ags del sistema Rh son de naturaleza proteica. El antígeno D posee la mayor capacidad antigénica. • Quienes posean el factor Rh serán: Rh (+) • Quienes NO lo posean: Rh (-)

Se enfrenta una gota de sangre entera del paciente con los reactivos compuesto por Ac monoclonales dirigidos a los polisacáridos del GR y al factor Rh: antiA, antiB y anti Rh

Incompatibilidad Rh Técnica de aglutinación directa/indirecta en tubo: Coombs directa Para detectar IgG y/o fracciones de C’ que se encuentran fijados in vivo a la superficie del GR. Su positividad significa que la persona tiene Acs contra sus GR. Coombs indirecta Se busca autoAcs contra GR presentes en suero. Una prueba positiva indica que hay Acs contra Ags de Gr.

Prueba de Coombs Se detectan Acs Antic-D u otros Acs que atacan la membrana del GR., mediante el agregado del suero de Coombs (antiglobulina). Anemia hemolítica autoinmune / Anemia hemolítica inducida por drogas /Eritroblastosis fetal / LES

Prueba de Coombs indirecta Screening de suero de donantes / Titulación de anticuerpos maternos / Pruebas de compatibilidad sanguínea

VDRL- No treponémica T. Pallidum Bacterias helicoidales muy móviles VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) Microscópica RPR (Rapid Plasma Reagin) Con partículas de carbón. Tarjetas con círculos de 18mm Macroscópica

Tipos de anticuerpos Anticuerpos inespecíficos o reaginas: Frente a los lípidos que se liberan de los tejidos. Aparecen 1-3 semanas tras la lesión primaria. Se correlacionan con multiplicación activa. 2. Anticuerpos específicos o treponémicos: Aparecen rápidamente. Suelen ser positivos toda la vida.

Técnica: Floculación de liposomas Antígeno: Solución alcohólica de cardiolipina, colesterol y lecitina Detectan: “Reaginas” IgG e IgM anti material lipídico Método: Floculación Cualitativo (pesquisa) Semicuantitativo (seguimiento)

POSITIVO: PROZONA??????? NEGATIVO POSITIVO

Efecto “Prozona” En muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas no se observe aglutinación. Se debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles (como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitación). En este caso, el título de Ac sigue siendo la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible.

Reacciones de aglutinación pasiva se basan en el empleo de una partícula aglutinante inerte a la cual se la ha unido un antígeno. Ejemplos podemos mencionar: HAI Toxoplasmosis HAI- Chagas ASTO.

Soportes: Glóbulos rojos (Hemaglutinación) Partículas de látex Tipos de reacciones de aglutinación pasiva según la identidad de la especie “pegada” a las partículas aglutinantes: Reacciones de aglutinación pasiva directa Reacciones de aglutinación pasiva reversa.

ANTICUERPOS ANTI-PCR UNIDA A PARTICULA DE LATEX PCR: PROTEINA HEPATICA DE FASE AGUDA CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO

GAMMA GLOBULINA HUMANA CON PARTICULAS DE LATEX CONTROL POSITIVO RF: FACTOR REUMATOIDEO MIDE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS IGM ANTI IGG ANORMAL PRODUCIDO POR LOS LINFOCITOS B DE LA MEMBRANA SINOVIAL DE ARTICULACIONES DE PERONAS ENFERMAS DE ARTRITIS REUMATOIDEA REACTIVO: GAMMA GLOBULINA HUMANA CON PARTICULAS DE LATEX CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO MUESTRA: PRESENCIA DE AC IGM ANTI IGG

Concepto de “Título” Título la inversa de la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. NO es posible determinar la concentración de Ac sino que, en el mejor de los casos, será posible calcular un título de Ac.

Inhibición de la Hemaglutinación:HAI

Seroconversión Teniendo dos muestras de suero de un mismo paciente tomadas a diferentes tiempos, es posible comparar mediante esta técnica el título de Acs en ambas muestras. Se denomina SEROCONVERSIÓN a la aparición de Acs o al aumento del título de Acs en 4 veces en un periodo entre 3 y 4 semanas.

Detección de Acs IgG e IgM+IgG Anticuerpos IgM indicio de enfermedad activa. Prueba de aglutinación en presencia y ausencia de 2 Mercaptoetanol.

Interacción primaria: IE con sonda Tipo de sonda: Isótopos radiactivos Fluorocromos Enzimas Método de separación Homogéneos Heterogéneos Diseño del ensayo Competitivos No competitivos -Sándwich

Ensayo competitivo

Ensayo no competitivo

Método homogéneo / heterogéneo

RIA- Radioinmunoanálisis SONDA: YODO 125 COMPETITIVO HETEROGENEO

IRMA SONDA YODO 125 NO COMPETITIVO HOMOGENEO

FPIA INMUNOENSAYO POR POLARIZACION DE FLUORESCENCIA HOMOGENEO COMPETITIVO SONDA FLUOROCROMO LUZ POLARIZADA TAMAÑO DE PARTÍCULAS- VELOCIDAD DE ROTACIÓN

INMUNOENSAYOS ENZIMATICOS (EIA) SONDA: ENZIMA Fosfata alcalina Peroxidasa de rábano picante Ureasa Catalasa Galactosidasa B. SEPARACION Placas de microtiter Tubos de plástico Partículas magnéticas.

DETECCION DE LA SEÑAL Emisión de luz Cambio de color Fluorescencia Quimioluminiscencia. DISEÑO: Competitivo: Detección de hormonas- Marcadores tumorales No competitivo: Anticuerpos para hepatitis-HIV

Enzimoinmunoenzayo (Enzime-linked-inmunoabsorbent assay). ELISA ELISA INDIRECTO: DETECCION DE ANTICUERPOS

ELISA Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich). DETECCION DE ANTÍGENOS

MEIA INMUNOENZIMOENSAYO POR MICROPARTICULAS Ensayo: HETEROGÉNEO NO COMPETITIVO Los componentes del MEIA suspendidos en un buffer optimizado son: Micro partículas de látex unidas al Ac específico contra el Ag a medir. Sonda: Enzima Fosfatasa alcalina unida al Ac. Sustrato de la enzima: fosfatas 4 metil umbelliferona fluorescente (MUP) Separación: matriz de fibra de vidrio sirve para fijar los complejos.

CLIA QUIMIOLUMINISCENCIA Quimioluminiscencia: Reacción química (OXIDO- REDUCCION) donde la energía se libera en forma de luz. Ensayo: HETEROGENEO- NO COMPETITIVO Reacción química de alto rendimiento que produce una molécula fluorescente. Esta fluorescencia no se produce por excitación luminosa por una fuente de luz sino por una reacción química redox donde interviene una enzima (HRP: Peroxidasa del rábano picante), agua oxigenada y un sustrato orgánico oxidable (esteres de acridina, derivados del rutenio.) La fase sólida es una micropartícula magnética y la separación se realiza por un imán.

CLIA

ECLIA ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA Este ensayo NO es enzimático pero se incluye en este grupo de métodos por su similitud metodológica. Al igual que CLIA generan a partir de sustratos productos capaces de emitir fotones al pasar de un estado energéticamente superior a uno de energía inferior más estable pero su origen es electroquímico y no una reacción enzimática. Ensayo no competitivo, el anticuerpo utilizado recubre micro partículas imantadas, que luego de la formación del CI, se fijan a un electrodo por magnetismo. El Ac está conjugado con un marcador derivado del rutenio capaz de emitir fotones cuando se aplica una pequeña diferencia de potencial sobre el electrodo. La energía lumínica la detecta un fotomultiplicador.

INMUNOCROMATOGRAFIA  

WESTERN BLOT La técnica de Western blot surge en el contexto de los métodos de análisis de ácidos nucleicos, aunque no los analiza directamente, sino que analiza el producto de expresión de los genes: las proteínas. Es una técnica de electroforesis e inmunotransferencia

INMNUNOMARCACIÓN

CITOMETRIA DE FLUJO

Validez: Es el grado en que un test mide lo que se supone que debe medir. ¿Con que frecuencia el resultado del test es confirmado por procedimientos diagnósticos más complejos y rigurosos? La sensibilidad y la especificidad de un test son medidas de su validez. Reproductividad: es la capacidad del test para ofrecer los mismos resultados cuando se repite su aplicación en circunstancias similares. La variabilidad biológica del hecho observado, la introducida por el propio observador y la derivada del propio test, determinan su reproductividad. Seguridad: La seguridad viene determinada por el valor predictivo de un resultado positivo o negativo. ¿Con que seguridad un test predecirá la presencia o ausencia de enfermedad? Ante un resultado positivo de un test ¿qué probabilidad existe de que este resultado indique presencia de la enfermedad? Veremos posteriormente que esta probabilidad está muy influenciada por la prevalencia de la patología.

La sensibilidad es la capacidad del test para detectar la enfermedad La sensibilidad es la capacidad del test para detectar la enfermedad.→→ Screening Especificidad es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo sano, es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo→→ Confirmatorio