FASES PARA CROMATOGRAFÍA Licda. Carol villatoro de santisteban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

GENERALIDADES Fase estacionaria (FS) Fase móvil (FM) Sistema cromatográfico Elección según propósito del análisis, características de la muestra, características de los analitos Interacción FS-analito Polaridad

Fases estacionarias

FASES ESTACIONARIAS Factor clave para la SEPARACIÓN Características de la FS Identidad química Estructura física: (Partículas de soporte, configuración en el espacio, tipos de interacción) Forma de contacto entre fases (plano, columnas) Configuración del soporte (partículas de relleno, pared del capilar)

ADSORCIÓN Fase estacionaria sólida y polar Carbonato de calcio Sílica Alúmina Na2SiO3 +H2O + 2HCl = Si(OH)4 + 2NaCl

REPARTO Fase estacionaria líquida Partículas de soporte: sílica, vidrio+sílica, polímeros FS unida físicamente o químicamente (reparto o fase enlazada) Película superficial de fase estacionaria sobre partícula de soporte

FASE ENLAZADA Unión covalente soporte-FS Sílica – Siloxanos Equivalente a película muy fina Características de la partícula determinantes para grado de sililación

AFINIDAD Aplicación bioquímica Interacción antigeno-anticuerpo Alta selectividad

INTERCAMBIO IÓNICO Analitos con carga eléctrica FS (enlazada) cargada Intercambiadores aniónicos (FS +, analito -) Intercambiadores catiónicos (FS -, analito +) FM con contraión Competencia (intercambio) analito-contraión

EXCLUSIÓN O PERMEACIÓN EN GEL Interacción FS-analito puramente física Tamaño y forma --- Peso molecular y conformación Poros o canales – recorridos distintos

Fases Móviles

FASES MÓVILES Factor clave para la ELUCIÓN Características de la FM Composición química (polaridad) Estabilidad (estado físico, composición, interacción con otras sustancias, interferencias instrumentales)

Polaridad Armonización en las polaridades analito-FS-FM Similitud FM-analito – tiempo de retención

Polaridad

Mezclas Elución isocrática Elución en gradiente Uno o varios solventes Composición constante Elución en gradiente Dos o más solventes Composición varía en función del tiempo Índice de polaridad de la mezcla: sumatoria de índices individuales por fracción en volumen

INTERACCIONES

Interacciones C. de adsorción: Analito y FM compiten por adsorberse sobre la FS Fase Normal Gradiente: aumento de polaridad

Interacciones C. de reparto (incluyendo fase enlazada): Analito se transfiere entre FM y FS en la interfase Fase Normal Gradiente: aumento de polaridad Fase Reversa Gradiente: disminución de polaridad Polaridad de la FM influye en conformación molecular de la FS

Interacciones C. de exclusión y c. de gases: FM sólo transporta al analito libre. Poca interacción FM con FS Poca interacción FM con analito

Interacciones C. de afinidad Elución en gradiente Fase de retención: FM sólo transporta al analito Fase de elución: FM interactúa con el analito o con la FS FM compite con FS por enlazarse con el analito FM modifica o se une a FS, evitando la unión FS-analito.

Interacciones C. de intercambio iónico Analito y FM compiten por adsorberse sobre la FS Elución en gradiente Fase de acondicionamiento: FM se une a FS (atracción electrostática) Fase de retención: FM y analito compiten Fase de elución: FM interactúa con el analito o con la FS FM se une a FS FM modifica al analito evitando la unión FS-analito

Gracias por su atención FIN Gracias por su atención