Tecnología del ADN recombinante

A tres décadas de la primera planta transgénica Definir DNA recombinante ¿Qué es un transgénico? Definir vectores Definir células recombinantes ¿Qué es la biolística y la electroporación? Definir plásmido Explicar la formación de una planta transgénica ¿Para qué se utiliza la biotecnología? (Ingeniería genética)

ADN recombinante: es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN (a menudo de especies diferentes) que se combinan in vitro en la misma molécula de DNA.

ADN Recombinante La tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permite aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De ese modo podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzcan una proteína que le sea totalmente extraña.

¿Cómo lo logramos?

Necesitamos: Reconocer el gen adecuado que queremos copiar Cortar y pegar el fragmento de ADN Usar un medio de transporte para ese nuevo fragmento de ADN Insertar en el nuevo organismo Clonación Estudiar el éxito del procedimiento

¿Cómo encontrar el gen adecuado? IMANES BIOLÓGICOS: Sondas Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Además contiene una “marca” que permite revelar su unión a la secuencia elegida. Son coloreadas durante su síntesis con nucleótidos marcados con fluorescencia.

¿Cómo cortar y pegar el fragmento de ADN? ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Video: https://www.youtube.com/watch?v=Z5Ki4aesVYM

Enzimas de restricción Son enzimas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces del material genético en un punto específico. Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones opuestas el mismo orden de nucleótidos. 5’ G T T A A C 3’ 3’ C A A T T G 5’

Enzimas de restricción Son suceptibles a cambios de temperatura, pH, etc. Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.

Enzimas de restricción Las endonucleasas son de gran importancia para la ingeniería genética, ya que permiten desarrollar técnicas de clonación. Permite realizar mapas de restricción y determinar si existe homología entre otras moléculas de DNA. Son extraídas de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.

Enzimas que cortan moléculas de DNA en una cantidad limitada de ubicaciones específicas. Son específicas y reconocen una secuencia de DNA corta determinada (sitio de restricción), para cortar ambas cadenas de DNA en puntos específicos de este sitio. El DNA de una célula bacteriana se protege de las propias enzimas de restricción agregando un compuesto químico a las adeninas o citosinas dentro de las secuencias reconocidas por las enzimas (Mecanismo de defensa)

Sitios de restricción simétricos (5´ 3´) Reconocen secuencias que contienen que contienen entre cuatro y ocho nucleótidos (pb) Produce muchos cortes produciendo un conjunto de fragmentos de restricción

Las enzimas de restricción permiten hacer diferentes cortes Las enzimas de restricción permiten hacer diferentes cortes. Estos cortes pueden dejar extremos romos, cuando cortan de forma pareja en ambas cadenas o extremos cohesivos cuando cortan de forma escalonada, dejando extremos de diferentes longitudes. Las asociaciones son permanentes a través de la enzima ligasa

Endonucleasas

Usos de las enzimas de restricción Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología moderna: 1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.  2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos.  

3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de interés clonado.

¿Cómo introducir ADN recombinante en el nuevo organismo?

MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes: Transformación Microinyección Lipofección Electroporación Transfección Microproyección o biobalística

Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, sólo es utilizado sobre ovocitos o cigotos. Pero a favor del método, puede prescindirse del vector e introducir directamente el ADN seleccionado.

Lipofección: El ADN recombinante se introduce en pequeñas vesículas Lipofección: El ADN recombinante se introduce en pequeñas vesículas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula.

Electroporación: método físico en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.

Transfección: método físico de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de infección viral.

Microproyección o biobalística: método físico en el que se utiliza una micropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. Se utiliza sobre cultivos celulares o "in vivo" sobre órganos como piel, hojas, etc.

Transformación: es un tratamiento físico-químico para bacterias Transformación: es un tratamiento físico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya que pueden penetrar los ADN recombinantes en el interior celular. Requiere un vector.

¿Qué es un vector? Son plásmidos o virus, capaces de mover genes de un organismo a otro y son capaces de ingresar a una célula y replicarse dentro de ella. Naturales Plásmidos Virus - Bacteriófagos TIPOS

Plásmidos Tipos de vectores Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas. - Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases). - Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula.

Plásmido 1- Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente de tamaño pequeño. 2- Se encuentran en muchas especies bacterianas. 3- Son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto le permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. 4- Pueden contener genes que contribuyen a la superviviencia en condiciones especiales.

Plásmido Así, los plásmidos se utilizan como vectores de fragmentos de ADN. Para esto, se combina el fragmento de ADN con el plásmido, generando un nuevo plásmido con dicho gen en su secuencia. ¿Cómo?

Plásmido Para esto, se debe utilizar sobre el plásmido, la misma enzima de restricción, que rinda los mismos extremos del fragmento de ADN previamente seccionado. Y por medio de una ligasa, permita la unión entre en fragmento de ADN y el plásmido utilizado.

¿Cómo decido qué enzima de restricción debo utilizar sobre el plásmido? Cada plásmido utilizado, posee una secuencia específica de nucleótidos. En base a dicha secuencia, se reconoce qué enzima de restricción se pueden utilizar y en qué sector de plásmido van a realizar el corte. Teniendo en cuenta que debe corresponderse al fragmento de ADN seleccionado.

Plásmido Una vez seleccionado el plásmido y la secuencia recombinante, debo elegir la enzima de restricción a utilizar. Prestando especial atención a: Cortes en ADN recombinante, así como en plásmido. Prestar atención a las zonas del plásmido que quiero mantener o eliminar. Origen de replicación Genes plasmídicos

Planta transgénica

Clonación Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona. Los tipos de células anfitrionas son: Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo costo de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables. Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales: Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas. Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables. Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.

Resumiendo http://www.bionova.org.es/animbio/anim/IngGen2web.swf

Proceso mediante el cual se obtiene la insulina

Ingeniería genética (otros usos) USOS Y APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA Entre los usos y aplicaciones podemos nombrar: - Mejorar las vacunas contra las enfermedades de los animales. - Productos humanos puros, como la insulina y la hormona del crecimiento humano en cantidades comerciales. - Antibióticos existentes por métodos más económicos. - Nuevos tipos de antibióticos. - Plantas con resistencia a algunos pesticidas, insectos y enfermedades. - Plantas con cualidades nutricionales mejoradas. En un humano, se pueden resaltar los siguientes usos: - Para reparar un defecto genético. - Para incrementar un proceso natural del organismo (como la tasa de crecimiento). - Para crear resistencia a las enfermedades o al daño externo. - Para evitar que el organismo haga algo que no haría normalmente. - Para obtener microorganismos que producen la insulina de los humanos para los diabéticos. - Han aumentado las expectativas de los científicos en eliminar enfermedades como el cáncer, y aumentar la longevidad eliminando las desventajas del crecimiento. - La clonación y el genoma humano

Continuará…