UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIHUAHUA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS   Microbiología de los Alimentos Actividad # 3 Enumeración selectiva e identificación de cultivos mixtos de Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei y Bifidobacterium lactis en leche fermentada Ramón Adalberto Ortega Camacho

Introducción La denominación yogur se debe utilizar solamente cuando la leche es fermentada por Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Los productos lácteos fermentados son los medios más populares de la entrega de las bacterias probióticas en los alimentos. Entre ellas, las cepas de L. acidophilus, L. casei y Bifidobacterium lactis son el complejo que predomina en los productos probióticos comerciales. La presencia de múltiples especies en estos productos hace que la enumeración diferencial de bacterias iniciadoras probióticos sean difíciles debido a la similitud en los requisitos de crecimiento y perfiles bioquímicos, que pueden falsearse en momentos determinados. 1

Los métodos de cultivo independiente para la identificación de bacterias basados ​​en el análisis genético se han convertido en una herramienta valiosa. Para conseguir una identificación rápida y fiable de las especies, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han convertido en un método muy popular, ya que estas técnicas tienen la ventaja de analizar el producto en su conjunto. 2

Objetivos Desarrollar metodologías selectivas en placas para la enumeración e identificación de cultivos mixtos de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei y B. lactis en los productos lácteos fermentados basado en un medio libre de antibióticos y diferentes condiciones de incubación. Aplicación de un procedimiento independiente de cultivo basado en el análisis de PCR-DGGE a la rápida detección e identificación de las especies mezcladas en los productos lácteos fermentados. 3

2.1. Microorganismos y condiciones de cultivo Cepas: S. thermophilus RET-31  L. delbrueckii subsp bulgaricus LBY-27 L. acidophilus LA-5 L. paracasei subsp. paracasei LC-01, B. lactis BB-12 S. thermophilus se cultivó en caldo de M-17 con 2% de lactosa. Lactobacillus delbruecki subsp bulgaricus y B. lactis se cultivaron en condiciones anaerobias en caldo MRS con 0.05% l-cisteína hidrocloruro L. acidophilus se cultivó aeróbicamente en caldo MRS. Las incubaciones se llevaron a cabo por 18-24h a 37°C L.paracasei subsp. paracasei  se cultivo aeróbicamente en caldo MRS. Las incubaciones se llevaron a cabo por 18-24h a 30°C 4

Procedimientos selectivos Las condiciones de cultivo descritas anteriormente fueron seleccionados como métodos de referencia. Los medios se suplementaron con un 1,5% de agar bacteriológico (Scharlab, Barcelona, España) y la incubación se extendió a 48 h para S. thermophilus y 72 h para B. lactis y lactobacilos. 5

S. thermophilus. Inoculación de diluciones apropiadas mediante la técnica de vertido en placa de agar M-17, 1% de lactosa e incubación a 45°C por 24h  L. delbrueckii subsp. Bulgaricus. diluciones en caldo MRS, con 0.2% de Tween80, se completo con 1% de fructosa, 0.8% de ácido hidrolizado de caseína, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-fructosa). se incubo en jarras anaerobias a 45°C por 72 h. Colonias algodonosas-esponjoso de 2-3mm L. acidophilus. diluciones en caldo MRS fermentación enriquecido con 0.2% de Tween80, suplementado con 1% de maltosa, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-maltosa). Se incubo 20% CO2  a 37°C por 72h. Colonias rugosas, planos, con bordes irregulares y diámetro de 1-2mm  L. paracasei subsp. paracasei. vertido en placa diluciones en caldo MRS suplementado con 1% de rafinosa, 0.05% LiCl, 0.05% de cisteína, y 1.5% de agar (MRS-rafinosa). Las placas se incubaron en jarras anaerobias a 45 ° C durante 72 h. colonias blancas, suaves y circulares de diámetro 2-3 mm B. lactis se llevó a cabo por vertido en placa, caldo MRS, 1% de rafinosa, 0,05% LiCl, 0,05% de cisteína, y% de agar 1,5 (MRSraffinose). Las placas se incubaron en jarras anaerobias a 45 ° C durante 72 h. 6

Prueba de eficiencia Precisión y exactitud. Se determinó por la comparación entre los recuentos bacterianos obtenidos con métodos selectivos y de referencia. Reproducibilidad. fue probado por el análisis de muestras idénticas por dos operadores diferentes y el uso de diferentes equipos. Al mismo tiempo, se evaluó el efecto de la matriz para la enumeración de bacterias en la leche fermentada 8

Selectividad y análisis de especificidad Selectividad y análisis de especificidad. los cultivos de los cinco especies bacterianas se mezclaron en el nivel de 10 7UFC ml-1para cada cepa y diluciones apropiadas se inocularon en el medio selectivo 9

Enumeración de recuentos viables de bacterias Se analizó vida útil para el rendimiento de los métodos selectivos. Recuentos viables se determinaron en las muestras (1 ml) mediante el uso de diluciones decimales de serie preparados en solución de Ringer suplementado con 0.05% de cisteína. Diluciones apropiadas se sembraron por duplicado y se analizaron usando los métodos selectivos descritos anteriormente. 10

Identificación de colonias Se verificó mediante PCR la enumeración específica. Primers específicos para cada especie fueron diseñados dentro de las regiones variables de los genes que codifican ARNr 16S de  S. thermophilus , L. paracasei subsp. paracasei , L.delbrueckii subsp. bulgaricus y L. acidophilus usando el módulo Lasergene PrimerSelect   Primers específicos para cada especie para la identificación de B. lactis fueron diseñados sobre la base de las regiones variables de genes transaldolasa 11

Análisis PCR-DGGE Con el fin de obtener ADN bacteriano a partir de leche fermentada, las muestras se neutralizaron a pH 6.5 NaOH 1m y adición de EDTA 0.2% 10 ml, pH 12, para causar la dispersión de micelas de caseína. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación y se mezcló (1:1) con perlas de vidrio, se recogieron por centrifugación y se obtuvo ADN genómico a partir del extracto libre de células. 12

ADN se utilizó como plantilla para la amplificación por PCR 40-bp GC (5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GGG GCA GCG CGG GGG G-3 ') para obtener productos de la PCR adecuados para la separación por DGGE . 13

Resultados y discusión Comparación de recuentos bacterianos usando métodos selectivos y de referencia. La incubación en aerobiosis a 45°C por 24h en agar M17-lactosa se ​​encontró adecuado para la enumeración selectiva de S. thermophilus, impidió el crecimiento de L. paracasei subsp.paracasei, L. delbrueckii subsp. bulgaricus y B. lactis crecieron en condiciones anaeróbicas. La extensión del período de incubación de 48 h permitió colonias en forma de puntos de L. acidophilus. 14

ttab ¼ 2.29. 15

Enumeración de bacterias en productos de leche fermentada usando los métodos selectivos Promedios de ocho lotes de cada producto analizado más de 4 semanas. 17

Identificación por PCR-DGGE de las especies presentes en leche fermentada La técnica permite una separación distinguible de fragmentos, que muestra un gran potencial detección e identificación para el análisis de estos productos 18

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CONCLUSIONES El uso combinado de los medios de placas selectivas y diferentes condiciones de incubación proporcionaron un enfoque eficaz libre de antibiótico para la enumeración selectiva de S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei y B. lactis. La eficiencia de los métodos selectivos se verificó mediante la evaluación del rendimiento usando parámetros estadísticos tales como precisión, exactitud, reproducibilidad, la selectividad y especificidad, y por la identificación de las especies enumeradas por especies específicas de PCR. Que la combinación de análisis de PCR y DGGE específico de la especie muestra un gran potencial de detección y la identificación para la verificación de las especies precisa de etiquetado en la leche fermentada sin aislamiento previo de las bacterias. 20