+ Evaluación de métodos de descontaminación para la recuperación de micobacterias de crecimiento rápido. Jesús Torres Coy 1,2 ; Aileen Farreras 2 y Jacobus de Waard 2. 1 Escuela de Biología. Facultad de Ciencias. UCV. 2 Laboratorio de Tuberculosis. Instituto de Biomedicina. UCV/ MPPS ,Caracas. INTRODUCCIÓN La mayoría de las especies de micobacterias descritas hasta ahora pertenecen a las llamadas Micobacterias No-Tuberculosas (MNT) dentro de las cuales se encuentran las de crecimiento rápido, referidas a aquellas micobacterias que necesitan menos de 7 días para producir colonias visibles sobre medios de cultivo sólidos (Runyons y Timpe, 1954). Las micobacterias de crecimiento rápido (MCR) son de gran importancia clínica ya que son responsables de patologías relativamente frecuentes como infecciones de piel, infecciones de tejidos blandos e infecciones por tratamientos post-mesoterapia en personas condicionadas al SIDA o a situaciones de inmunodepresión, ya que son organismos oportunistas (Caminero, 2001). Debido a que la transmisión persona a persona de las patologías producidas por las MCR es rara, se ha aceptado que la fuente de transmisión es el ambiente, el cual habitan naturalmente. El aislamiento de MCR a partir de muestras clínicas requieren tanto del uso de métodos de descontaminación como de medios selectivos en función de recuperar el mayor número de micobacterias (expresado en unidades formadoras de colonia) de la muestra a tratar. Los protocolos de aislamiento de MCR se derivan de los usados para el diagnóstico de la tuberculosis pero no se ha evaluado aún si los mismos son adecuados para las mismas. En todo caso es importante conocer que la recuperación de MCR va a depender de factores del método seleccionado como: tipo de agente químico descontaminante, concentración del descontaminante, tiempo de exposición, entre otros (Jaramillo y McCarthy, 1986). OBJETIVOS Establecer el porcentaje de recuperación de algunas micobacterias de crecimiento rápido con diferentes agentes químicos descontaminantes. Evaluar un medio selectivo con PANTA para la recuperación de algunas micobacterias de crecimiento rápido. MATERIALES y MÉTODOS RESULTADOS y DISCUSIÓN Se prepararon suspensiones de aislados clínicos de M. abscessus, M. fortuitum y M. mucogenicum ajustadas a un patrón Mc Farland 1 (aproximadamente 3x108 UFC/mL) para realizar los siguientes ensayos: 1. Titulación de la suspensión de MCR en placas de agar Tripticasa de soya (control) y Tripticasa de soya con PANTA (Polimixina B (40 U/mL); Anfotericina B (4 µg/mL); ácido Nalidixico (16 µg/mL); Trimetropina (4µg/mL) y Azolocilina (4 µg/mL)) (Tomado de Radomski y col., 2010). 0.5 mL Factor de dilución: 1/10 Dilución: 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 agar Tripticasa de soya (ATS) ATS + PANTA 0.1 mL Suspensión bacteriana ajustada a un patrón Mc. Farland 1 (3x108 UFC/mL), 4.5 mL de caldo Tripticasa de soya (TS) Figura 1. Porcentaje de recuperación de algunas micobacterias de crecimiento rápido luego de ser tratadas con diversos agentes químicos descontaminantes. Independientemente de la concentración de HPC utilizada se evidenció que existe una mayor recuperación de las MCR utilizadas cuando se emplea esta sal de amonio cuaternario por 20 minutos. M. abscessus demostró ser la más resistente a los ensayos con HPC (entre 40-45% de recuperación) seguido por M. fortuitum (25%) y por último M. mucogenicum que resultó ser la más sensible (menos del 10% de recuperación). Los otros agentes químicos descontaminantes (ácido oxálico al 5% y NaOH al 2% y 4%) tuvieron un bajo porcentaje de recuperación en las cepas evaluadas ya que solo menos del 10% del inóculo inicial fue recuperado transcurrido el tiempo de incubación. Incubación a 37º C 2. Titulación de la suspensión de MCR en placas de agar Tripticasa de soya luego de los ensayos de recuperación con los agentes químicos descontaminantes usados. + Titulación como en el ensayo anterior en ATS. Especie Titulo (UFC/mL) % de recuperación Control con PANTA M. abscessus 1.67x109 1.16x109 69.46 M. fortuitum 4x108 3.4x108 85 M. mucogenicum 6.2x107 Tabla 2. Efecto del PANTA en la recuperación de las micobacterias de crecimiento rápido empleadas en este estudio. 200 L Suspensión bacteriana ajustada a un patrón Mc. Farland 1 (3x108 UFC/mL), 200 L Agente químico descontaminante* Incubación Tabla 1. Agentes químicos descontaminantes utilizados en los ensayos de recuperación de MCR. 10 2% y 4% NaOH 20 5% Ácido oxálico 0.05%; 0.75% y 1.5% Cloruro de Hexadecil Piridinium (HPC) Tiempo de Incubación (min.) Concentraciones finales empleadas (%p/v) (*) Agente químico descontaminante utilizado Actualmente es utilizado con frecuencia el compendio de antibióticos y fungicidas conocido como PANTA para la recuperación de MCR a partir de muestras clínicas. En nuestro estudio se evidenció que el uso del mismo no afecta la recuperación de M. abscessus ni M. fortuitum; pero si el de M. mucogenicum la cual es sensible a Trimetropina, Polimixina B y Azlocilina (componentes del PANTA), lo cual concuerda con el estudio de Adekambi (2009) (ver Tabla 2). El porcentaje de recuperación se calculó mediante la siguiente fórmula: % de recuperación = Titulo de la suspensión bacteriana sin tratamiento (control) x 100 Titulo de suspensión bacteriana después de los tratamientos de descontaminación CONCLUSIONES y RECOMENDACIONES Las MCR se consideran patógenas oportunistas y en los últimos años se han asociado con frecuencia a infecciones localizadas y diseminadas, incluyendo brotes de infección por contaminación de equipos médicos. Las MCR predominantes en infecciones humanas son M. abscessus, M. fortuitum y M. mucogenicum (en menor proporción). De manera que en el caso de que se sospeche infecciones por MCR, recomendamos el uso de HPC en el procesamiento de las muestras, en virtud de que se obtiene un mayor aislamiento; a la vez que concluimos que el uso de NaOH (que se emplea en el procesamiento de muestras de esputo para el diagnóstico de tuberculosis) no es apropiado como agente descontaminante para la recuperación de MCR a partir de muestras clínicas. Por otro lado en infecciones por M. mucogenicum no se recomienda el uso de PANTA en medios de cultivo. BIBLIOGRAFÍA Adékambi, T (2009). Mycobacterium group infections: a review. Clin Microbiol Infect. 15: 911-918. Caminero, J.A (2001). Micobacterias atípicas. BSCP Can Ped 5: 237-246. Jaramillo, V.L., McCarthy, C.M (1986), Recovery of Mycobacterium avium after treatment with chemicals decontaminants. Can J Microbiol. 32: 728-732. Runyon, E.H., Timpe, A. (1954). The relationship of “atypical” acid-fast bacteria to human disease. A preliminary report. J Lab Clin Med 44: 202-209.