VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN MICROBIANA (MICROBIOLÓGICA Y MOLECULAR) EN LA BÚSQUEDA DE BACILLUS subtilis Y PRUEBAS DE ANTAGONISMO FRENTE A HONGOS FITOPATÓGENOS Autores: Br. Mario Sergio Flores Hernández Br. Erick Vicente Roque Castellano Tutores: Dr. Leandro Páramo Aguilera Ing. José Méndez Úbeda 6 y 7 de septiembre de 2016 Managua, Nicaragua

VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA Sumario Introducción Objetivos Generalidades Metodología Resultados preliminares Microorganismos aislados. Microorganismos identificados molecularmente. Pruebas de antagonismo. Conclusiones VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA

VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA INTRODUCCIÓN Agricultura menos sostenible - Plagas y enfermedades - Malas practicas agrícolas: Quema, Uso indiscriminado de plaguicidas y fertilizantes - Cambio climático VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA

Identificación de género Bacillus Agricultura menos sostenible Modelos agrícolas sustentables Control biológico Aislamiento de microorganismos Identificación de género Bacillus Pruebas de antagonismo in vitro Microbiológica y molecular VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA

VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA OBJETIVOS Objetivo General Caracterizar microbiológica y molecularmente la diversidad microbiana cultivable de bioinsumos comerciales en la búsqueda de Bacillus subtilis para el control de hongos fitopatógenos de interés agrícola y desarrollo de pruebas de antagonismo. Objetivos Específicos Explorar la diversidad microbiana posible de obtener por métodos cultivables utilizando medios enriquecidos partiendo de bioinsumos comerciales procedentes de dos zonas del país (occidente y norte). Identificar los microorganismos seleccionados a través de pruebas moleculares.   Realizar pruebas de antagonismo in vitro de las cepas promisorias de bacterias frente a hongos fitopatógenos. VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA

VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA GENERALIDADES Conceptos básicos: Bioinsumos. Medios de cultivos. Control biológico. Antagonismo microbiano. VII CONGRESO NACIONAL DE INGENIERÍA AGRÍCOLA

Género Bacillus Tienen un gran potencial para su uso en la agricultura: Por su capacidad de producir sustancias para el control de patógenos. Presentan una alta velocidad de crecimiento. Sobreviven en diversas condiciones, lo que ofrece perspectivas en la obtención de biopreparados eficientes. Promotores de crecimiento. GENERALIDADES

Actividad antifúngica de Bacillus subtilis La especie de B. subtilis se puede utilizar a través de la producción extracelular de antibióticos; se ha evidenciado la actividad antifúngica de amplio espectro de B. subtilis en el control de hongos fitopatógenos, expresado mediante la creación de metabolitos causantes de alteraciones en la estructura y la ultra estructura fúngica. GENERALIDADES

Ventajas del uso de productos biológicos Reducción de costos de insumos como fertilizantes y plaguicidas químicos. Mejora de la calidad de las cosechas. Obtención de productos orgánicos. No contamina suelos ni fuentes de agua ya que se desintegran rápidamente. GENERALIDADES

DISEÑO METODOLÓGICO Ubicación del estudio. Métodos.

DISEÑO METODOLÓGICO Ubicación del estudio Laboratorio de Microbiología de las Aguas del Programa de Investigación Estudios Nacionales y Servicios Ambientales (PIENSA) DISEÑO METODOLÓGICO

MÉTODOS DISEÑO METODOLÓGICO 1. Recolección de bioinsumos comerciales 2. Aislamiento de los microorganismos 3. Identificación morfológica de los microorganismos 4. Identificación molecular de los microorganismos 5. Pruebas de antagonismo in vitro 4 muestras Siembra Purificación Conservación Tinción Gram Esporas Secuenciación Bioinformática Preselección Confrontación DISEÑO METODOLÓGICO

1. Recolección de bioinsumos comerciales 2 líquidos 2 sólidos MÉTODOS

2. Aislamiento de los microorganismos Preparación de medios de cultivo. Inoculación de las muestras (siembra). Selección y aislamiento de los microorganismos. Conservación de las cepas. MÉTODOS

Preparación de medios de cultivo MÉTODOS

Aislamiento de microorganismos Muestras 1 AN PDA PCA 2 3 4 Aislamiento de microorganismos Aislamiento por dilución-Siembra por extensión o bañado Rotulado Incubadora MÉTODOS

Selección y Aislamiento de microorganismos Aislamiento por agotamiento siembra por estrías Aislamiento por repique periódico MÉTODOS

3. Identificación morfológica de los microorganismos Bacterias - Tinción de Gram. Hongos (Observación de esporas). Levadura (Tinción simple). MÉTODOS

4. Identificación molecular de los microorganismos ITS 1 para hongos. ARNr 16S para bacterias. Secuenciación de ADN Análisis de las secuencias Corrección de las secuencias. Comparación con base de datos. Alineamiento de las secuencias. Construcción árbol filogenético. MÉTODOS

5. Pruebas de antagonismo in vitro Preselección de bacterias con potencial antagonista. Técnica de confrontación dual: 5 fitopatógenos, 6 tratamientos y 1 testigo, 3 repeticiones. Cepa 1 Cepa 2 Cepa antagonista Fitopatógeno A Fitopatógeno A MÉTODOS

RESULTADOS PRELIMINARES Microorganismos aislados. Microorganismos aislados molecularmente. Microorganismos antagonistas de fitopatógenos.

MICROORGANISMOS AISLADOS No muestra Estado Procedencia No bacterias No hongos Filamentosos Levaduriforme 1 Sólido Estelí 5 4   2 6 3 Líquido Chinandega 9 Total 23 8 RESULTADOS PRELIMINARES

BACTERIAS RESULTADOS PRELIMINARES Se aislaron 23 bacterias. 22 eran de forma bacilar y 1 cocal. RESULTADOS PRELIMINARES

Se aislaron 8 hongos filamentosos. RESULTADOS PRELIMINARES

RESULTADOS PRELIMINARES HONGO Se aisló 1 levadura, posible Aureobasidium pullulans. RESULTADOS PRELIMINARES

MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS MOLECULARMENTE Secuenciación genética a 15 bacterias y 5 hongos fitopatógenos. Bacterias: posibles Bacillus subtilis, Bacillus sp., Bacillus pumilus, Lysinibacillus sp. Hongos: Fusarium equiseti, Fusarium sp., Alternaria alternata. RESULTADOS PRELIMINARES

FITOPATÓGENOS UTILIZADOS Se utilizaron 5 hongos fitopatógenos: 3 de papa (Alternaria y Fusarium) y 2 de maní (Fusarium). RESULTADOS PRELIMINARES

PRUEBAS DE ANTAGONISMO IN VITRO Se preseleccionaron 6 cepas bacterianas con potencial antagónico frente a Alternaria de papa y Fusarium de papa y de maní. RESULTADOS PRELIMINARES

PRUEBAS DE ANTAGONISMO IN VITRO De las 6 bacterias preseleccionadas dos posibles Bacillus subtilis. Pruebas de confrontación in vitro % de inhibición RESULTADOS PRELIMINARES

CONCLUSIONES

¡ GRACIAS POR SU ATENCIÓN ! “Tu debes ser el cambio que deseas ver en el mundo” Mahatma Gandhi