MARCACIÓN Y REVELADO DE SONDAS

MARCACIÓN DE SONDAS

Técnicas para preparar Sondas radiactivas Una sonda genética consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia que se busca y a la que se unirá de manera específica. La unión al ADN, puede detectarse marcando la sonda con "etiquetas” químicas. Estas etiquetas pueden ser moléculas marcadas con radiactividad o moléculas portadoras de átomos fluorescentes, entre otros. Son técnicas para introducir marca radiactiva en segmentos clonados de DNA o RNA: Nick translation Random priming Fill in

Nick translation Esta técnica es usa desde 1977 y la diseñó P.W.J Rigby Materiales: DNA molde doble cadena DNAasa I (genera el nick) DNA pol I dNTPs marcados

Características DNA pol I produce el Movimiento de la mella (nick translation), gracias a su actividad exonucleasa 5’ → 3’ Sustituyendo los nucleótidos preexistentes con nucleótidos altamente radiactivos (32P), es posible preparar DNA marcado.

Protocolo Mix the following components: 10X reaction buffer for DNA Polymerase I 2.5 µl mixture of 3 dNTPs, 1 mM* (without the labeled dNTP) 1.25 µl [alfa-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol (3000 Ci/mmol) 1.85-3.7 MBq (50-100 µCi) DNase I, RNase-free freshly diluted to 0.002 u/µl** 1 µl DNA Polymerase I, E.coli 0.5-1.5 µl (5-15 u) template DNA 0.25 µg Water, nuclease-free to 25 µl Immediately incubate at 15°C for 15-60 minutes. Terminate the reaction by adding 1 µl of 0.5M EDTA, pH 8.0. Take an aliquot (1 µl) to determine efficiency of the label incorporation. A specific activity of  DNA at least 108 cpm/µg  DNA is expected. If needed, the labeled DNA may be separated from the unincorporated radioactive precursors on Sephadex G-50 or Bio-Gel P-60 column.

Random Priming Materiales: DNA pol = Fragmento Klenow de la DNA pol I de E. Coli (carece actividad exonucleasa 5`3`) a un pH = 6.6 (actividad exonucleasa 3´5´ reducida) dNTP´s = 1 marcado, 3 sin marcar. Primers = Deben ser de 6 o 7 nucleótidos de longitud. Todas las secuencias posibles representadas en igual frecuencia (47 = 16384). DNA molde = DNA lineal doble cadena de 1Kb de longitud.

Característica: Desnaturalización e hibridación del ADN con random primers. Síntesis de DNA por el fragmento Klenow. Desnaturalización y obtención de sondas marcadas.

Fill in Materiales: Enzimas de restricción. Conocer la secuencia de reconocimiento de las enzimas DNA pol 1 DNA molde dNTP´s marcados

Características. Marca el extremo 3’ de la cadena. Se debe elegir bien el nucleótido marcado. Se aconseja uno que este lejos de el extremo para evitar la acción de exonucleasas. Las enzimas deben generar cortes escalonados en donde la cadena mas larga sea la 5’ Se utiliza en ensayos como el proofreading.

REVELADO

Sondas radioactivas

SONDAS NO RADIOACTIVAS Directa FLUORESCENCIA Indirecta Act. ENZIMATICA