INTRODUCCIÓN Los métodos de cultivo y la identificación de bacterias se basan en métodos fenotípicos. Permiten analizar rasgos y comportamiento bacterianos.

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1 METODOS ANALITICOS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACION DE MICOORGANISMOS BASADOS EN ACIDOS NUCLEICOS

2 INTRODUCCIÓN Los métodos de cultivo y la identificación de bacterias se basan en métodos fenotípicos. Permiten analizar rasgos y comportamiento bacterianos observables con facilidad.

3 El uso de los métodos fenotípicos se asocia con limitaciones importantes:
La incapacidad de crecer de algunos patogenos con requerimientos especiales de cultivo La imposibilidad de mantener la viabilidad de ciertos patógenos en las muestras durante el transporte al laboratorio El tiempo que demoran el cultivo y la identificación de los patógenos de crecimiento lento La falta de métodos fiables para identificar ciertos microorganismos que crecen in vitro La necesidad de usar una cantidad considerable de tiempo y recursos para establecer la presencia y la identidad de patógenos en las muestras

4 BIOLOGIA MOLECULAR La detección y la manipulación de los ácidos nucleicos DNA Y RNA permite que los genes microbianos se examinen directamente (métodos genotípicos) en lugar de a través de sus productos como las enzimas (métodos fenotípicos) Para que el diagnóstico de laboratorio de las enfermedades infecciosas siga siendo oportuno y eficaz las estrategias que integran las técnicas convencionales, las basadas en ac. nucleicos y las analíticas, deben seguir evolucionando.

5 Varios métodos que se utilizan para analizar el DNA o el RNA microbianos permiten detectar, identificar y caracterizar etiologías infecciosas. Todos los procedimientos moleculares implican la manipulación y el análisis directo de los genes , en su totalidad o en parte, en lugar que sus productos génicos. La mayoría de los métodos son adaptables al diagnóstico de infecciones virales, bacterianas, micóticas o parasitarias.

6 ASPECTOS GENERALES DE LOS METODOS MOLECULARES
Como las pruebas de diagnóstico moleculares se basan en la naturaleza constante y bastante predecible del DNA y RNA, la comprensión de estos métodos requieren un conocimiento y la estructura de los ácidos nucleicos

7 Los primeros pasos … PCR ADN Electroforesis QUENCHER ARRAYS ARN RFLP Hibridación Secuenciación DOT BLOT NASBA Clonación HIBRIDACIÓN REVERSA

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11 Secuenciación y digestión enzimática de ácidos nucleicos
Métodos moleculares Hibridación Amplificación Secuenciación y digestión enzimática de ácidos nucleicos

12 METODOS DE HIBRIDACIÓN DE AC NUCLEICOS
Se basan en la capacidad que poseen dos cadenas de ácido nucleico con secuencias de bases complementarias (Homólogas) de unirse específicamente entre sí y formar una molécula de cadena doble o dúplex o híbrido.

13 Como la hibridación requiere homología en la secuencia de ac
Como la hibridación requiere homología en la secuencia de ac. Nucleicos, una reacción de hibridación positiva entre dos cadenas de ac. Nucleico, cada una de ellas procedente de una fuente distinta, indica el parentesco genético entre los dos microorganismos que donaron cada una de las cadenas de ácido nucleico para la reacción de hibridación. Los ensayos de hibridación requieren que una cadena de ac. Nucleico (sonda) provenga de un microorganismo de identidad conocida y la otra la cadena (diana) proceda de un microorganismo desconocido que se desea detectar o identificar

14 La hibridación positiva identifica al microorganismo desconocido como idéntico a aquel del que proviene la sonda. En una prueba de hibridación negativa el microorganismo no se detecta o no se identifica. Los componentes de ac. Nucleico de cadena simple (monocatenario) usados en la hibridación pueden ser RNA O DNA, por lo que pueden formarse dúplex DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, según el diseño específico del ensayo de hibridación.

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16 Pasos y componentes de la hibridación
Los pasos básicos en un ensayo de hibridación son: Producción y marcado de la sonda del ácido nucleico Preparación del ácido nucleico diana de cadena simple Mezcla e hibridación de los ácidos nucleicos, diana y sonda Detección de la hibridación

17 PRODUCCIÓN Y MARCADO DE SONDAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
En concordancia con el requisito de complementación para la hibridación el diseño de la sonda (longitud, y secuencia de bases) depende de la secuencia del ácido nucleico por determinar (diana). En consecuencia la selección y el diseño de una sonda depende del uso que se le dará.

18 Todas las pruebas de hibridación deben contar con un medio para detectar la hibridación. Esto se logra mediante el empleo de una molécula indicadora que forma químicamente un complejo con la sonda monocatenaria de DNA. Las sondas pueden marcarse con varias de estas moléculas, pero con mayor frecuencia se usan marcadores radioactivos, biotina-avidina, digoxigenina o quimioluminiscentes.

19 Preparación del ácido nucleico diana
El ácido nucleico diana debe ser de cadena simple y es preciso mantener la integridad de su secuencia de bases. La omisión de estos requisitos producirá reacciones de hibridación negativas por factores diferentes a la ausencia de ácido nucleico diana negativo.

20 En general los pasos de la preparación son :
la destrucción enzimática o química de la envoltura microbiana para liberar el ácido nucleico diana la estabilización del ácido para conservar la integridad estructural y si es DNA, la desnaturalización a una sola cadena, que es necesaria para su unión al ácido nucleico complementario de la sonda

21 Mezcla e hibridación de la diana y la sonda
La capacidad de la sonda de unirse a la diana depende del grado de homología de la secuencia de bases entre las dos cadenas y del medio determinan el grado de restricción de una reacción de hibridación y el grado de restricción puede determinar el resultado de la reacción.

22 La restricción de la hibridación es afectada en gran medida por
La concentración de sales en el sistema amortiguados de la hibridación. La temperatura La concentración de agentes desestabilizadores

23 Con mayor restricción se requiere un mayor grado de complementariedad de los pares de bases entre la sonda y el ácido nucleico diana para obtener una hibridación exitosa. En condiciones de menor restricción las cadenas con menor complementariedad de pares de bases todavía pueden sufrir hibridación. A medida que aumenta el grado de restricción, incrementa la especificidad.

24 Detección de la hibridación
Depende de la molécula indicadora para marcar el ácido nucleico sonda y del sistema de hibridación. AUTORRADIOGRAFIA COLORIMETRIA FLUORESCENCIA QUIMIOLUMINISCENCIA

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26 Sistemas de hibridación
Sistema en solución Las cadenas de nucleótidos sonda y diana se reúnen en una mezcla de reacción líquida que facilita la formación dúplex de modo que la hibridación se produce mucho más rápidamente que con el uso de fase sólida

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28 Sistemas en fase sólida

29 Hibridación in situ Permite identificar el patógeno dentro del contexto de la lesión anatomopatológica que produce. Se basa en el empleo de células o los tejidos de los pacientes como fase sólida. Útil porque combina el alcance del diagnóstico molecular con la información adicional que proporciona el exámen histopatológico

30 Sondas de ác nucleicos peptídicos: mejoran las características de la hibridación y permiten obtener resultados más rápidos y específicos. No se degradan por la acción de enzimas ubicuas como nucleasas y proteasas, proporcionan un producto de duración más prolongada para aplicaciones diagnósticas. Hibridación con amplificación de la señal: para aumentar la sensibilidad de las pruebas de hibridación.

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32 Métodos de amplificación
Los que utilizan la técnica de reacción en cadena de la Polimerasa PCR Los que no se basan en la PCR

33 GENERALIDADES DE LA PCR Y SUS DERIVACIONES
Es el método de amplificación de ácido nucleico diana usado con mayor frecuencia. Combina los principios de la hibridación de ácidos nucleicos complementarios con los de la replicación que se aplican repetidas veces en varios ciclos. Esto proporciona gran cantidad de diana, que puede detectarse con facilidad por varios métodos

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35 PCR convencional Comprende 25 a 50 ciclos repetitivos cada uno incluye 3 reacciones secuenciales: Extracción y desnaturalización de la diana Apareamiento con el cebador Extensión del dúplex cebador-diana

36 Detección de los productos de la PCR
Básicamente implica el uso de una sonda marcada que sea específica para la secuencia Diana que se encuentra dentro del amplicón. Permite la visualización del producto de PCR. Proporciona especificidad al asegurar que el amplicones la secuencia diana en estudio y no el resultado de una amplificación inespecífica.

37 Derivaciones del método de PCR
PCR múltiple PCR anidada PCR con cebado aleatorio PCR cuantitativa PCR con transcripción inversa

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43 Métodos que no se basan en PCR
Los que amplifican la señal utilizada para detectar el ácido nucleico diana. Reacción en cadena de la ligasa Los que amplifican directamente el ácido nucleico. Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos, Amplificación mediada por transcripción, Amplificación por desplazamiento estándar

44 Secuenciación y Digestión enzimática de ácidos nucleicos
Por métodos moleculares que permiten dilucidar alguna parte de la secuencia genómica de un patógeno proporcionan una herramienta poderosa a la microbiología diagnóstica. La secuenciación, la digestión enzimática y la electroforesis de ácido nucleicos permite proporcionar información acerca de la secuencia de nucleótidos para detectar, identificar y caracterizar los microorganismos de importancia clínica de forma independiente o junto con los procedimientos de amplificación y secuenciación

45 Secuenciación de ácidos nucleicos puede utilizarse para
Detectar y clasificar patógenos humanos, antes desconocidos Identificar diversos patógenos microbianos conocidos y sus subtipos Determinar que cambios específicos de los nucleótidos resultantes de las mutaciones son los que determinan la resistencia a antibióticos. Establecer el parentesco entre aislamientos de la misma especie

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47 Sondas de DNA de alta densidad
El método se basa en la hibridación de un ácido nucleico diana marcado con un compuesto fluorescente con grandes grupos de oligonucleótidos sintetizados en localizaciones precisas sobre un soporte de vidrio. El patrón de hibridación de la sonda con los diferentes oligonucleótidos se usa para obtener información acerca de la estructura primaria del diana

48 Digestión enzimática y electroforesis de ácidos nucleicos
Son métodos menos precisos que la secuenciación de ácidos nucleicos para identificar y caracterizar microorganismos. La digestión enzimática del DNA se logra con cualquiera de las enzimas endonuclesas de restricción que reconoce una secuencia de nucleótidos específica. Una vez localizado el sitio de reconocimiento o de restricción la enzima cataliza la digestión lo que provoca un corte.

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50 Los patrones obtenidos se denominan patrones de restricción
El número de fragmentos y el tamaño producidos por la digestión enzimática enzimática dependen de la longitud del ácido nucleico que esta en digestión. Después de la digestión los fragmentos se someten a electroforesis en gel de agarosa, para separar por tamaños. Los patrones obtenidos se denominan patrones de restricción

51 Las diferencias entre los patrones de restricción de los microorganismos se conoce como POLIMORFISMO DE LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN RFLP

52 APLICACIONES DE LOS MÉTODOS BASADOS EN ÁCIDOS NUCLEICOS
DETECCIÓN DIRECTA DE MICROORGANISMOS EN MUESTRAS DE PACIENTES. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DESARROLLADOS EN CULTIVO CARACTERIZACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS MAS ALLA DE SU IDENTIFICACIÓN

53 DETECCIÓN DIRECTA DE MICROORGANISMOS
Especificidad: los métodos dependen de la especificidad de una secuencia de nucleótidos de un microorganismo determinado. No descarta la posibilidad de una infección mixta en la que integren otros gérmenes Sensibilidad: las técnicas de amplificación aumentan la sensibilidad

54 Aplicaciones Cuando uno o dos patógenos causan la mayoría de las infecciones Solo se necesita saber la identificación No hay ningún método diagnóstico fiable Los métodos diagnósticos son lentos La cuantificación influye en el tratamiento del paciente

55 IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DESARROLLADOS EN CULTIVO
Puede usarse la hibridación, la amplificación o el análisis de RFLP para establecer su identidad. La identificación es inmediata con un inóculo suficiente Establece identificación definitiva

56 Caracterizacion más alla de la identificación
Detección de resistencia a antimicrobianos Investigación del parentesco de cepas

57 PFGE