* adirmo@gmail.com; hernandezad@unesur.edu.ve EFECTO DEL GRADIENTE DE PERCOLL SOBRE LA VITALIDAD Y LA INTEGRIDAD DEL ACROSOMA EN ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE TOROS BRAHMAN Effect of gradient Percoll on the vitality and integrity acrosome in cryopreserved sperm bulls Brahman Hernández A *1,2,5, Quintero A.2, Nava-Trujillo H.2,3, Osorio- Meléndez C.2, Rubio-Guillén J.2,4, González-Villalobos D. 2,4 1 Producción Agropecuaria, Universidad Experimental del Sur del Lago, Santa Bárbara, estado Zulia, Venezuela. 2Laboratorio de Andrología, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia, Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. 2,3Investigación y Desarrollo, Fundo La Rosita, El Guayabo, Edo. Zulia, Venezuela. 4Unidad de Investigación en Producción Animal (UNIPA), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad del Zulia, Maracaibo, estado Zulia, Venezuela. 5 Grupo de Investigación para el Desarrollo dela Producción Animal Universidad Experimental del Sur del Lago, Santa Bárbara, estado Zulia, Venezuela * adirmo@gmail.com; hernandezad@unesur.edu.ve Introduccion Resumen Los parámetros espermáticos clásicos que se consideran en un análisis de calidad seminal incluyen, en general, motilidad, concentración, vitalidad y anomalías morfológicas. Las principales razones por las cuales las pruebas de evaluación seminal rutinaria, no han podido demostrar una clara relación predictiva con la resistencia a la criopreservación y con el potencial reproductivo de un semental, son las siguientes: primero, no reflejan adecuadamente la fisiología o funcionalidad de la población de los espermatozoides que permanecen viables; segundo, existen diferencias técnicas en los procedimientos empleados por los diferentes laboratorios, lo que afecta la repetibilidad de los resultados; y tercero, la mayoría de las pruebas utilizan técnicas de evaluación visual de gran subjetividad por lo que generan una alta variabilidad entre laboratorios y entre operadores (Gravance y Davis 1995, Foxcroft y col. 2008). La mayoría de los espermatozoides se dañan durante la congelación y descongelación del semen, estos procesos conducen a la reducción de la motilidad espermática y daños en las estructuras de membrana (Celeghini y col. 2008). Por lo tanto, los tratamientos empleados para seleccionar los espermatozoides móviles de semen congelado y descongelado son esenciales cuando la fertilización in vitro (FIV) se lleva a cabo (Lee y col. 2009). Los gradientes de densidad de Percoll, son ampliamente utilizados para la selección de células por centrifugación (Lee y col. 2009, Petyim y col., 2009). Se compone de partículas de sílice coloidal cubiertas con polivinilpirrolidona (PVP) y selecciona las células de esperma de acuerdo a su etapa de maduración y de integridad (Oshio 1988). El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del gradiente discontinuo de Percoll en semen congelado de toros Brahman, sobre la vitalidad y la integridad del acrosoma. Se examinaron cuatro toros Brahman Rojo, tres eyaculados de cada uno. Los espermatozoides se sometieron a un método de tinción de eosina-nigrosina y azul de Comassie, evaluado por microscopio de luz de campo claro, utilizando objetivos de inmersión (100X), antes y después del uso del gradiente de Percoll. Los porcentajes (%) (media ± DE) de los resultados de vitalidad (vivos-muertos) obtenidos fueron: 58,16 ± 11,42; 41,83 ± 11,42 y 80,21 ± 7,37; 19,79 ± 7,37, respectivamente, antes del gradiente de Percoll y después del gradiente de Percoll, respectivamente (P>0,005), e integridad del acrosoma (intactos-destruidos) obtenidos fueron: 64,15 ± 6,44; 36,40 ± 6,43 y 82,50 ± 9,22; 17,50 ± 9,22, antes del gradiente de Percoll y después del gradiente de Percoll (P>0,005), respectivamente. Estos resultados indican que mediante la utilización del método de separación de espermatozoides de gradiente discontinuo de Percoll, puede ser usado en los sistemas de fecundación in vitro, debido a que se obtiene mayor porcentaje de espermatozoides vivos y con acrosoma intacto. Palabras Clave: acrosoma, Brahmán, criopreservación, espermatozoides, Percoll   Materiales y Metodos Para la realización del experimento se utilizó semen congelado de cuatro toros de raza Brahman, tres eyaculados por cada toro, con edades comprendidas entre 5 y 8 años. La valoración de la vitalidad espermática se realizó con la tinción de eosina-nigrosina (Tamuli y Watson, 1994). El número de espermatozoides vivos (no teñidos) se calculó luego de contar como mínimo 200 células. La integridad acrosómica se evaluó utilizando la tinción de azul de Comassie (Larson y Miller, 1999). El número de acrosomas intactos se determinó observando el frotis con un microscopio óptico y bajo objetivo de inmersión (100X), Se preparó dos gradientes de Percoll al 90 y 45% en el medio SP-TALP. En un tubo ependorf de 1,5 ml, se colocó 300 µl de Percoll al 90%, y al 45%, se depositó alrededor de 200 µl de semen en la parte superior y se centrifugo a 5000 G durante 5 minutos. se descarto, se prepararon los frotis para las tinciones azul de Coomassie y eosina-nigrosina. Resultados Cuando se compara los porcentajes vitalidad espermática antes y después del Percoll, podemos observar que existe diferencia (P>0,005), 58,16 ± 11,42 contra 80,21 ± 7,37 vivos respectivamente similar a lo publicado por Zuccarri y col. 2008, al igual que la integridad del acrosoma se puede observar diferencia (P<0.005), 64,15 ± 6,44 contra 82,50 ± 9,22 con acrosoma intacto respectivamente. Espermatozoide vivo Espermatozoides muertos EFECTO DEL PERCOLL SOBRE LA VITALIDAD EN ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE TOROS BRAHAMAN TORO N VITALIDAD ANTES PERCOLL VITALIDAD POSTPERCOLL % VIVOS % MUERTOS Media ± DE (1) 3 60.33 ± 5.48 39.66 ± 5.48 79.17 ± 8.12 20.83 ± 8.12 (2) 64.33 ± 5.48 35.66 ± 5.48 80.33 ± 1.52 19.67 ± 1.52 (3) 45.00 ± 13.93 55.00 ± 13.93 75.33 ± 10.78 24.67 ± 10.78 (4) 63.00 ± 10.21 37.00 ± 10.21 86.00 ± 5.19 14.00 ± 5.19   12 58.16 ± 11.42 aa 41.83 ± 11.42aa 80.21 ± 7.37bb 19.79 ± 7.37bb aa P>0.005 EFECTO DEL PERCOLL SOBRE INTEGRIDAD DEL ACROSOMA EN ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVADOS DE TOROS BRAHAMAN Tinción de eosina-nigrosina TORO N ACROSOMA ANTES PERCOLL ACROSOMA POSTPERCOLL % INTACTO % DESTRUIDO Media ± DE (1) 3 62.05 ± 7.25 37.94 ± 7.25 82.67 ± 6.65 17.33 ± 6.65 (2) 65.88 ± 1.53 34.11 ± 1.53 81.33 ± 10.01 18.67 ± 10.01 (3) 66.55 ± 7.53 35.66 ± 7.53 82.67 ± 17.03 17.33 ± 17.03 (4) 62.11 ± 9.52 37.88 ± 9.52 83.33 ± 5.50 16.67 ± 5.50   12 64.15 ± 6.44aa 36.40 ± 6.43aa 82.50 ± 9.22bb 17.50 ± 9.22bb Espermatozoide con acrosoma intacto Espermatozoide con acrosoma destruido aa P>0.005 Referencias Bibliograficas Conclusiones Estos resultados indican que se pueden obtener espermatozoides con viabilidad e integridad del acrosoma  superior, mediante la utilización del gradiente discontinuo de Percoll, Por lo tanto, el uso de este método de separación de espermatozoides en los sistemas de fecundación in vitro puede ser más conveniente, debido a que se obtiene mayor cantidad de espermatozoides vivos y con acrosoma intacto.    Celeghini y col 2008 Foxcroft y col 2008 Gravance y Davis 1995 Larson y Miller 1999 Lee y col 2009 Oshio 1988 Petyum y col 2009 Tamui y Watson 1994 Zuccarri y col. 2008   Tinción de azul de comassie