Potencial antimicrobiano y composición química del aceite de Eucalyptus globulus en fases líquida y vapor en contra de microorganismos de deterioro alimentario. Alejandro Martínez Monreal P190558

Introducción El eucalipto es un árbol perenne, nativo de Australia, que incluye alrededor de 900 especies y subespecies (Brooker y Klenig). Los extractos de eucalipto presentan actividad antibacteriana y antifúngica, (Takahashi, Kokubo, y Sakaino, 2004). Los aceites en fase líquida son eficaces contra patógenos de origen alimentario y microorganismos causantes de deterioro en grandes concentraciones. El aceite esencial en fase de vapor puede ser muy eficaz contra los patógenos transmitidos por los alimentos y bacterias de descomposición en concentraciones relativamente más bajas que la fase líquida.

Materiales y métodos

Productos químicos y cepas: Aceites esenciales (Natural Aromatics Private Limited, Nueva Delhi, India). El medio de crecimiento (Himedia, India y Qualigens, India). Cepas de bacterias (Escherichia coli ADH5, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus). Cepas de hongos (Penicillium digitatum, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Mucor spp., Rhizopus nigricans y Fusarium oxysporum). Levaduras (Candida albicans y Sacchromyces cerevisiae). Fueron obtenidas de la instalación central de cultivos microbianos, Departamento de Biotecnología y de Ingeniería Bioquímica, Instituto de Tecnología de Delhi.

Preparación del inóculo: Las cepas de bacterias y hongos usados en este estudio se hicieron crecer en caldo de Mueller Hinton (MHB) y medio de cultivo de papa dextrosa (PDB).

Pruebas antimicrobianos Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) por el método de dilución en agar: El CMI de aceites esenciales se determinó mediante el ensayo de dilución en agar. Se modificaron con varias concentraciones de aceite esencial E. globulus (es decir, 0.27-36 mg/ml). Los valores de CMI se determinaron como la concentración más baja del aceite que previene el crecimiento visible de microorganismos. Hongos y levaduras Agar Papa Dextrosa (PDB) Bacterias Mueller Hinton (MHB)

Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) y la concentración mínima fungicida (CMF) utilizando el método de dilución en caldo El CMB y CMF de aceites esenciales se determinaron mediante un ensayo de dilución de caldo (NCCLS M27-A, método de referencia recomendado para las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos). Un intervalo de concentraciones de aceites esenciales (0,27-36 mg/mL) se prepararon para las bacterias y hongos. Cada matraz se inoculó con 106 ufc/mL de las cepas de prueba. Los matraces que contienen sólo Tween-80 pero sin aceite esencial se utilizaron como control. CMB/CMF se definieron como la concentración más baja a la que no se observó ningún crecimiento.

Método de difusión en pozos Pozos de 8 mm de diámetro se tomaron del agar y se le añadieron dosis de 10, 20, 30 y 40 µL de aceite esencial. Aceite de E. Globulus en 0.5% de Dimetil sulfóxido Cada cepa diluida en agua bidestilada a 106 ufc/mL 100 µL de cada cepa en las placas y se dejó secar Incubación durante 24 h a 30 ºC. Todas las placas se examinaron para detectar cualquier zona de inhibición del crecimiento, y se midieron los diámetros de las mismas. Todas las pruebas se realizaron por duplicado.

Método de volatilización de discos Se utilizó el siguiente método: Una porción de 100 µL de cada suspensión que contiene 106 ufc/mL se extendió sobre la superficie de la placa de MHA/PDA y se dejó secar. En un disco de papel (diámetro 6 mm, Sigma-Aldrich Inc., India) se colocaron cantidades variables de aceite esencial en la superficie interior de la tapa superior. Se varió el volumen de aceite esencial colocado en los discos de papel, es decir, 10, 20, 40 o 60 µl. Todas las pruebas se realizaron por duplicado. La placa inoculada con microorganismos se invirtió inmediatamente en la parte superior de la tapa y se sella con parafilm® para evitar la fuga de vapor. Las placas se incubaron a 30 ºC durante 24 h y se midió el diámetro de la zona de inhibición resultante en la alfombra bacteriana/fúngica.

Determinación del tiempo de muerte Estos experimentos se llevaron a cabo para los microorganismos seleccionados (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, B. subtilis y C. albicans) en una cámara compacta compuesta de material acrílico. Después de un período de tiempo determinado (0,5, 1, 2, 4, 8 y 12 h), las placas se separaron, cerraron, y se incubaron a 30 ºC durante 18-20 h. Todas las placas se utilizaron por duplicado.

Identificación de compuestos químicos La identificación de los picos se realizó por comparación de los espectros de masas con los espectros de masas disponibles en la base de datos de las bibliotecas NIST05 y WILEY8. La identificación de compuestos fue finalmente confirmado por comparación de sus índices de retención relativos con valores de la bibliografía (Davies, 1990).

Resultados y discusión

Actividad antimicrobiana CMI y CMB/CMF de aceite de E. globulus La CMI del aceite esencial del E. globulus se determinó contra diversas bacterias Gram negativas (E. coli ADH5, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa 106 ufc/ml, P. fluorescens) y Gram positivos (B. subtilis y S. aureus ), fúngicas (cepas de P. digitatum, A. flavus, A. niger, Mucor spp., R. nigricans y F. oxysporum) y levaduras (C. albicans y S. cerevisiae). Estos valores de CMI y CMB/CMF se muestran en la Tabla 1. Los aceites mostraron una inhibición de crecimiento dependiente de su concentración.

Pruebas de tiempo de muerte Las concentraciones a las que vapores de aceite de E. globulus mostraron efectos antimicrobianos significativos indican que puede haber posibilidades para el uso de E. globulus como aditivo a los productos alimenticios. Es necesario calcular el tiempo de exposición adecuado para lograr una desinfección completa o estabilización microbiana de los alimentos. Por lo tanto, se llevaron a cabo más experimentos para validar la eficacia de vapores de aceite de E. globulus en términos de tiempo de interrupción para E. coli, P. aeruginosa, P. fluorescens, B. subtilis y C. albicans mediante la exposición de las placas inoculadas a vapor de aceite de E. globulus en una cámara hermética durante 12 h. Los resultados de este estudio se muestran en la Fig. 1.

Fig 1. Pruebas de tiempo de muerte para el aceite esencial de E Fig 1. Pruebas de tiempo de muerte para el aceite esencial de E. globulus en fase vapor contra E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa, P, flourescens, B. subtilis y C. albicans. Los puntos de datos representan la media de los resultados publicados y la barra de error representa el rango de los resultados.

Composición química del aceite y vapor de aceite del E. globulus.

Conclusiones Los resultados de este trabajo han demostrado que el aceite esencial de E. globulus muestra potencial antimicrobiano contra una gama de microorganismos que deterioran los alimentos. La fase de vapor fue más eficaz en la inhibición de crecimiento microbiano y causó inhibición completa de hongos y cepas de levaduras. Un mayor porcentaje de hidrocarburos monoterpenos (54,7%) presentes en los vapores en comparación con el aceite (44,5%) podrían ser responsables de la mayor actividad antimicrobiana. Se requiere un estudio adicional in vivo para confirmar la actividad antimicrobiana de E. globulus en la fase de vapor, que puede ser usado para la preservación y/o la extensión de la vida útil de los alimentos crudos y procesados.

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