Cátedra Microbiología General FACENA – UNNE 2016 MICOBACTERIAS MARÍA VIVIANA BOJANICH Cátedra Microbiología General FACENA – UNNE 2016

Objetivo Conocer las principales características biológicas de los BAAR, su capacidad para producir infecciones, las posibilidades diagnósticas y las medidas profilácticas

MICOBACTERIAS Orden: Actinomycetales Suborden: Corynebacterineae Familias: - Corynebacteriaceae - Nocardiaceae - Mycobacteriaceae

Caracteres generales de las micobacterias Bacilos delgados, rectos o ligeramente curvados, a veces ramificados, solos o en pequeños grupos G+ (aunque se tiñen muy mal) • Ácido-Alcohol-Resistentes, se tiñen bien por Ziehl-Neelsen • Inmóviles no esporulados no capsulados carecen de fimbrias Aerobios Patógenos y saprofitos Más de 50 especies (agentes de la TB, lepra y paratuberculosis).

Taxonomía Familia Mycobacteriaceae Género Mycobacterium Especies M. tuberculosis M. bovis M. leprae Micobacterias atípicas

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS* (crecimiento lento y no cromógenas) *M. avium, M. aviumsubsp. paratuber-culosis, M. intracellulare, M. ulcerans (crecimiento lento y no cromógenas)

Mycobacterium tuberculosis R. Koch (1843-1910) (24/3/1882) ‘había observado y aislado el microorganismo que causaba la TB en el hombre y en el ganado bovino’

Género Mycobacterium Bacilos ácido-alcohol resistentes debido a la presencia de ácidos grasos en la pared. Aerobios estrictos. Pueden aparecer como saprófitos del suelo y el agua y pueden producir enfermedades La mayoría son de crecimiento lento (abundancia de lípidos dificulta el paso de nutrientes al interior de la célula).

Estructuras Pared celular fina (20 nm) La estructura de la pared celular es inusual. Incluye 4 tipos de polímeros: Peptidoglicano–Arabinogalactano–Ácidos micólicos–Lipoarabinomanano Además se incluyen lípidos de superficie (micósidos, sulfolípidos, etc.) Las micobacterias comparten la mayoría de los antígenos.

Peptidoglicano Tres características distintivas: 1) ácido N-glucolil murámico 2) presencia de 2 grupos amido sobre el glutamato y sobre el ácido meso-DAP 3) la presencia de 2 clases de uniones interpetídicas: D-ala- meso DAP meso DAP- DAP Hasta un 70% de los enlaces cruzados en el PG, consisten en puentes interpeptídicos entre residuos meso DAP. Este tipo de puentes se producen solo en las micobacterias.

El PG está unido al arabinogalactano por uniones fosfodiéster entre residuos de ácido murámico y una arabinosa. Alrededor de 1 de cada 10 residuos de arabinosa del polímero está estratificado por una molécula de ácido micólico.

Ácidos micólicos Factor de virulencia. Es el componente principal de la envoltura (hasta 60% del peso seco de la pared) Hidrofóbicos, forman la cubierta lipídica Uniones covalentes tipo éster a una arabinosa al final del arabinogalactano ramificado Factor de virulencia. • Probablemente previenen el ataque por proteínas catiónicas, lisozima y radicales de oxígeno en la vesícula fagocítica • Inhiben la absorción de nutrientes • Causan agregación bacteriana • Contribuyen al crecimiento lento

Lipoarabinomanano Es un glicolípido al final de la envoltura aunque está anclado profundamente en el peptidoglicano y en la membrana celular Tiene una estructura compleja (Un núcleo de manosas unidas a múltiples cadenas laterales ramificadas de arabinofuranosil-manosa y una unidad de fosfatidilinositol que puede ser utilizada como un puente de unión a otros elementos de la envoltura).

Otros Lípidos de superficie Micósidos: – Cera D: Ácido micólico+ arabinogalactano y éste a 4 NAG/NAM, a los que se unen 2 cadenas de tetrapéptidos. Una falsa cera. Tiene propiedades adyuvantes. – Factor Cordón: 6,6,dimicolil-trealosa (2 ácidos micólicos unidos a trealosa). - Asociado a la virulencia (es leucotóxico) Fosfolípidos (cardiolipina, fosfatidiletanolamina y Fosfatidilinositolmanósidos) - Implicados en la formación de granulomas. Sulfolípidos: glicolípidos sulfatados (ácidos grasos + trealosa)

Factores de virulencia Factor Cordón es responsable del crecimiento serpenteante (en forma de cordón o filamento) en el que los bacilos crecen. Es tóxico para los leucocitos, antiquimotáctico, interfiere con la función mitocondrial y juega un papel importante en el desarrollo de las lesiones granulomatosas Capacidad de adquisición de hierro requerido para la supervivencia en el interior de los fagocitos Sulfolípidos previenen la fusión fagosoma-lisosoma y hacen que los bacilos no estén expuestos a las enzimas lisosómicas (importante en la supervivencia intracelular) SOD (superóxidodismutasa): neutraliza la capacidad oxidante de los iones superóxido

Tuberculosis pulmonar M. tuberculosis - Patología Tuberculosis pulmonar Primoinfección: generalmente pasa desapercibida si el paciente es inmunocompetente Reinfección Tuberculosis extrapulmonar Meningitis Mastitis Pielonefritis Abscesos TBC miliar (múltiples focos infecciosos)

Diagnóstico de laboratorio Esputo, Orina, Punción de abscesos, Biopsias, etc. Coloración de Ziehl-Neelsen (Baciloscopía) Cultivo en Lowenstein-Jensen Incubar a 37ºC - 30 a 90 días, aerobiosis Coloración de Ziehl-Neelsen Identificación y Antibiograma (No siempre, sólo en casos especiales)

Baciloscopía Definición: Recuento de bacilos ácido alcohol resistentes en la muestra. Utilidad: Sirve para dar inicio al tratamiento y seguirlo. Técnica: Realizar dos extendidos con la muestra, colorear con Ziehl-Neelsen y observar al microscopio 100 campos, promediando el número de BAAR observados.

Ziehl-Neelsen/Kinyoun (1000x) Baciloscopía Ziehl-Neelsen/Kinyoun (1000x) Informe No se observan BAAR 1-9/100 campos Cuenta exacta 10-99/100 campos 1+ 1-10/campos 2+ > 10/campo 3+

Cultivo Es muy sensible, más sensible que la baciloscopía, aunque produce resultados tardíamente. Detecta únicamente bacilos vivos. Permite realizar las pruebas de sensibilidad. Es el mejor método para demostrar la curación de un paciente al finalizar el esquema terapéutico, como así también para demostrar fallas de tratamiento. Permite detectar los casos antes de que lleguen a infecciosos. Es el método de referencia que se tiene para evaluar todo nuevo método diagnóstico.

Para los casos de TBC extra pulmonar, el aporte del cultivo es variable , según la localización de la patología. La calidad del medio es un punto crítico. Se necesita infraestructura adecuada y personal capacitado Nivel de bioseguridad 2 como mínimo y cabinas de seguridad biológica Se trabaja en red con laboratorios de referencia regionales.

Cultivo Homogeneización y decontaminación de la muestra con NaOH. Crecim. como miga de pan Cultivo Homogeneización y decontaminación de la muestra con NaOH. 2. Medio de Lowenstein-Jensen Huevo (albúmina y lípidos) Verde de malaquita (inhibidor) Glicerol (fuente de carbono) Asparagina (fuente de nitrógeno) 3. Incubar a 37ºC durante 30 a 90 días, en aerobiosis Crecimiento lento: tiempo de replicación: 20 horas Colonias secas, amarillentas y rugosas

Método de Kudoh Ogawa Variante del Método de Petroff Económico Sencillo Suficientemente Sensible (confirma casos de baciloscopía positiva) Utiliza hisopos para tomar y procesar la muestra Medio a base de huevo en medio ácido Útil para procesar esputos en laboratorios sin condiciones de bioseguridad y equipamiento adecuado.

Reacción de Mantoux Definición: técnica para evaluar “in vivo” la inmunidad celular frente al bacilo tuberculoso. Antígeno: derivado proteico purificado (PPD). Antiguamente se usaba la tuberculina. Utilidad: Sirve para detectar contacto previo con el bacilo tuberculoso. Técnica: inocular 0,1 ml de PPD por vía intradérmica en el antebrazo. Leer la induración a las 48-72 hs.

Interpretación Negativa Positiva Dudoso No se observa induración o induración menor a 4 mm. No existió contacto o la persona es inmunosuprimida. Hay posibilidades de infección. Positiva Induración de 10 mm o más. Hubo contacto con la bacteria o sus antígenos por vacunación Dudoso Induración de 5 a 9 mm. Puede deberse a contacto con otras micobacterias

Vacunación Vacuna con el Bacilo de Calmette y Guerin (BCG). M. bovis vivo atenuado por repiques sucesivos en papa biliada. Se aplica por vía intradérmica. Sólo se vacunan los tuberculinos negativos (PPD negativa). Vacunar durante el primer mes de vida y al ingreso escolar previa reacción de Mantoux. Previene sobre todo la meningitis tuberculosa que generalmente es mortal.

Características de interés epidemiológico Muy sensible al calor (70ºC 5’ en leche) Resistente a los ácidos, álcalis y a muchos desinfectantes químicos (utilidad en la descontaminación de muestras) El Fenol al 2% o formol al 3% 3 h son muy eficaces. El Fenol al 5% muy eficaz con/sin materia orgánica Glutaraldehido al 2% es muy eficaz Etanol al 80% (10’ o menos): desinfección de piel y materiales de uso clínico. Con materia orgánica se reduce su acción. Oxido de etileno: moderadamente eficaz Derivados de amoniocuaternario, clorhexidina y yodóforos: ineficaces Yoduros de amoniocuaternario: muy eficaces

Se destruyen rápido por la luz solar o radiaciones UV M. tuberculosis y M. bovis no se multiplican en el medio ambiente pero sobreviven varios meses en el suelo o estiércol bovino Resistentes a la desecación. Si se protegen de la luz solar sobreviven semanas o meses Se destruyen rápido por la luz solar o radiaciones UV (4-10 veces más sensibles que E. coli)

Micobacterias atípicas El laboratorio de Koch, en Wollenstein, en 1872

pueden ser detectadas en muestras tomadas del hombre, son capaces de vivir libremente y por eso son llamadas “ambientales”. También se las conoce como “oportunistas” o “atípicas” (agrupa a las micobacterias que no se parecían al bacilo de la tuberculosis). No son atípicas, porque comparten todas las características que definen al género y la capacidad de vivir libremente no es excepcional entre las micobacterias. Las micobacterias ambientales son consideradas colonizantes banales o contaminantes agregados durante la toma o procesamiento de la muestra a menos que se reúna sólida evidencia que demuestre que están causando enfermedad. Estas micobacterias pueden integrarse fácilmente en los aerosoles, pero en este caso son los que se generan por movimientos de agua y aire en la naturaleza.

Los aerosoles son aspirados por el hombre y ésa es la vía por la que más frecuentemente lo infectan, pueden ingresar por vía digestiva o penetrar por alguna lastimadura de la piel o heridas. Normalmente colonizan el árbol respiratorio o el tracto digestivo o urogenital sin causar daño alguno. Más aún, el encuentro puede ser inmunológicamente efectivo y conferir protección contra las especies de micobacterias altamente patógenas. Muy excepcionalmente un individuo inmunocompetente es vulnerado por estas micobacterias, el riesgo aumenta cuando ha sufrido enfermedades pulmonares crónicas (tuberculosis, enfermedad obstructiva crónica, asbestosis, silicosis, etc.). Estas micobacterias tienen capacidad para subsistir en soluciones o instrumentos de uso hospitalario y prótesis, elementos que pueden ser vehículo de serias infecciones posquirúrgicas. No existe evidencia de que las micobacterias ambientales sean transmisibles de hombre a hombre.

Clasificación (Temple y Runyon) basada en la producción de pigmento, velocidad de crecimiento y características de las colonias GRUPO I: Crecimiento lento fotocromógenas: M. kansasii, M. marinum GRUPO II: Crecimiento lento escotocromógenas: M. gordonae, M. xenopi GRUPO III: Crecimiento lento no cromógenas: M. avium-intracellulare GRUPO IV: Crecimiento rápido: M. fortuitum, M. chelonei

El complejo de micobacterias oportunistas de mayor incidencia como patógeno es el integrado por M. avium y M. intracellulare (complejo MAI) y su localización más frecuente es la pulmonar. Siguen, en orden de frecuencia, algunas micobacterias de rápido desarrollo: complejo M. fortuitum, M. abscessus y M. chelonae. En algunas áreas geográficas se destaca la frecuencia de M. kansasii que es la más virulenta entre las micobacterias ambientales y la única que normalmente es sensible al esquema antituberculoso de primera línea. Las micobacterias ambientales pueden sobrevivir fuera del hospedador, si las condiciones no son extremas. Algunas micobacterias ambientales prefieren temperaturas más bajas para desarrollar especialmente las que suelen afectar a la piel y tejidos superficiales.

Diagnóstico de laboratorio Esputo, Orina, Punción de abscesos, Biopsias, etc.  Coloración de Ziehl-Neelsen Cultivo en Lowenstein-Jensen  Incubar a 37ºC 4 a 90 días Pruebas bioquímicas Antibiograma

Mycbacterium leprae

Lepra - Definición Infección crónica que afecta piel nervios periféricos, ojos y membranas mucosas producida por Mycbacterium leprae

Lepra - Agente etiológico Mycobacterium leprae es un bacilo ácido-alcohol resistente, no cultivable in vitro. Puede presentarse como: Elementos paralelos (paquete de cigarrillo) Masas esféricas o globis (multiplicación intensa en el interior de los macrófagos)

Patología Se denomina lepra y se conoce desde hace miles de años. La puerta de entrada es cutánea El hombre es el único reservorio El bacilo se disemina por vía linfática, hemática o neural. Se destruyen las terminales nerviosas, hay pérdida de sensibilidad y despigmentación de la piel. Existen tres tipos de lepra Tuberculoide: buena inmunidad celular. Afectación localizada. Lepromatosa: mala inmunidad celular. Afectación generalizada. Borderline: formas intermedias entre las anteriores.

Diagnóstico de laboratorio El bacilo no se cultiva. El diagnóstico se realiza por observación directa con Ziehl-Neelsen y por anatomía patológica. Se realiza un Triple BAAR, o sea se colorean con Ziehl-Neelsen tres muestras diferentes: Moco nasal Linfa de lóbulo de la oreja Linfa de la lesión Se informa el número de BAAR y la morfología

Lepra - Clínica

Reacción de Mitsuda Definición: técnica para evaluar “in vivo” la inmunidad celular frente al bacilo de la lepra. Antígeno: se utilizan bacilos muertos por calor denominados lepromina. Utilidad: Sirve para diferenciar los tipos de lepra en pacientes enfermos o la resistencia a ella en personas sanas, generalmente convivientes. Técnica: inocular 0,1 ml de lepromina por vía intradérmica en el antebrazo. Leer la induración a las 3 semanas.

Reacción de Mitsuda Interpretación Negativa: Positiva: Dudosa: No se observa induración. En enfermo: lepra lepromatosa En persona sana: susceptibilidad a la lepra Positiva: Induración de 3 mm o más. En enfermo: lepra tuberculoide En persona sana: resistencia a la infección. Dudosa: Induración de 1 a 2 mm. Aparece en los comienzos de la enfermedad

Epidemiología y Prevención El bacilo es eliminado por lesiones y moco nasal, siendo el hombre el único reservorio conocido. Para que exista el contagio debe haber contacto íntimo, prolongado y frecuente. Debe realizarse diagnóstico y tratamiento precoz. Debe administrarse quimioprofilaxis en contactos de pacientes leprosos. La vacuna con el Bacilo de Calmette y Guerin (BCG) produce inmunidad inespecífica para la lepra tuberculoide.

BIBLIOGRAFÍA Basualdo J. A. y cols. Microbiología Biomédica. Ed. Atlante. Segunda Edición. Año 2006. Sherris. Microbiología Médica. Ryan K. J., Ray C. G. Editorial Mc Graw Hill. 4ta. Edición. Año 2005. TUBERCULOSIS BOVINA. EL AGENTE. Elías F. Rodríguez Ferri. Universidad de León. Pumarola A. y cols. Microbiología y Parasitología Médica. Ed. Masson-Salvat Medicina. Segunda Edición. Año 1987.