Producción de bioetanol utilizando cultivos energéticos de segunda generación Patricio Portal, Guido Novelli, Arahí Prato, Nicolas Gurdo, Miguel Galvagno. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de Chascomús (IIB-INTECH) – Universidad Nacional de San Martín (UNSAM) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), San Martín, Buenos Aires, Argentina. Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Buenos Aires, Pabellón de Industrias, Ciudad Universitaria, CABA, Argentina INTRODUCCIÓN Planta y semillas de Jathropa y Jojoba La biomasa lignocelulósica (BLC) representa una materia prima importante para la producción de bioetanol por fermentación microbiana, dado que es una fuente de carbono-energía renovable y se produce en gran abundancia. Entre la BLC que además de ser un desecho agrícola y de no competir con otros sustratos como alimentos se encuentran residuos de Jatropha spy jojoba (Simmondsia chinensis), obtenidos después de la extracción de sus semillas para obtener aceites. Por otro lado dichos cultivos llamados energéticos de 2da generación, se desarrollan industrialmente en Argentina. Para que dicha materia prima pueda ser ¨fermentada¨ por las levaduras para producir el biocombustible, debe ser pre-tratada de manera tal de obtener azúcares fermentescibles por el microorganismo. Los pre-tratamientos habituales que se utilizan son físico-químicos y enzimáticos, de manera tal de eliminar la lignina y hacer la celulosa accesible a las enzimas que la hidrolizan. La hidrólisis sobre todo química de los sustratos libera inhibidores del metabolismo de la levadura: ésteres de forbol, furfurales y ácidos alifáticos. De tal manera que el biocatalizador utilizado (levadura) debe poder ser tolerante a dichos inhibidores, además de ser una buena productora y resistir a altas concentraciones de etanol. La resistencia a esta multiplicidad de estreses, que actúan en forma simultanea y sucesiva, se pueden alcanzar por ingeniería genética o evolutiva. Este trabajo explora los distintos pre-tratamientos de los BLC mencionados y distintos abordajes empleados para lograr cepas de levaduras etanologénicas adaptadas a los estreses mencionados. Mejores resultados obtenidos hasta la fecha: Hidrólisis de Jatropha curcas: 0,242g azúcares reductores/g de masa seca (96,71% del máximo teórico). Obtenido tras incubar 1h a 100⁰C en H2O (1:10 m/v) y luego 72hs a 50⁰C con 0,5ml Optimax/g muestra. Hidrólisis de Simmondsia chinensis: 0,479242g azúcares reductores/g de masa seca (90,35% del máximo teórico). Obtenido tras incubar 2h a 100⁰C en H2O (1:10 m/v) y luego 72hs a 50⁰C con 0,5ml Optimax/g muestra. Post-tratamiento: Overliming (sólo para hidrólisis ácida): CaO hasta pH 10,0, Tº ambiente, 1h, después H2SO4 hasta pH 6,0. Detoxificación: carbón activado 3,5% (m carbón/v hidrolizado), Tº ambiente, 1h. El post-tratamiento de detoxificación permite un mayor crecimiento de las levaduras (aprox.30% superior vs medio no detoxificado). Pre-tratamientos de la BLC Crecimiento y Fermentación: Cepas utilizadas: Scheffersomyces stipitis Y-7124, Saccharomyces cerevisiae Y-138 Medio: Hidrolizado de jatropha ([] final Az. Reductores = 8,5g/l) + extracto de levadura 1% + peptona 1%. Se hicieron experimentos inoculando los medios simultáneamente con las dos cepas y con un desfasaje de 24hs (Y-7124 a las 0hs y Y-138 a las 24hs). Mejor resultado para la producción de etanol a partir de medio preparado con hidrolizado de jatropha: 0,48g EtOH/g azúcares reductores (94,33% del máximo teórico). Se vió que los resultados al inocular simultáneamente Y-7124 y Y-138 son similares a los obtenidos si se inocula Y-7124 primero y a las 24hs se inocula con Y-138 (2,048g EtOH/l vs 2,027g EtOH/l, respectivamente, habiéndose consumido 4,82g y 4,21g de azúcares reductores), pero la eficiencia es superior al incubar desfasadamente (83,32% vs. 94,33% del valor teórico). Resumen de resultados obtenidos Muestras: residuos de prensada (“cake”) de Jatropha curcas y Simmondsia chinensis (jojoba). Pre-tratamiento: Deslignificado en medio alcalino: KOH 0,2M 1:10 m/v, 3hs, T° ambiente. Se determinó que el deslignificado elimina una parte significativa de los azúcares reductores, por lo que no conviene realizarlo. Hidrólisis ácida: Entre 0,1 y 6N de H2SO4. Rango de relaciones masa de muestra:volumen de medio de hidrolizado: 1:1 hasta 1:20 Rango de temperaturas de hidrólisis: 30-130°C. Rango de tiempos de hidrólisis: 30-180 minutos. Se ensayaron hidrólisis en un paso y en dos pasos (con 2 concentraciones de ácido, la segunda superior a la primera). Se determinó que los mejores resultados se obtienen con H2SO4 0,5N 1:10 m/v, 100°C, 3h en un solo paso. Hidrólisis alcalina: Entre 0,05 y 0,3 g CaO / g muestra seca. Rango de relaciones masa de muestra:volumen de medio de hidrolizado: 1:5 hasta 1:10 Se determinó que las mejores condiciones son 1g CaO/g muestra, 100⁰C, 2h. La hidrólisis alcalina deja residuos sólidos que requieren lavado, lo que diluye el hidrolizado y requiere una posterior concentración. Hidrólisis enzimática (realizadas luego de pretratamiento ácido o alcalino, como losindicados más arriba): Enzimas utilizadas: Accellerase 1500 (glucanasa, β-glucosidasa), Optimax (pululanasa, amilasa fúngica), Spezyme (α-Amilsa bacteriana). Rango de relaciones: 0,1-1,0ml enzimas/g de muestra. Rango de tiempos de hidrólisis enzimática: 24-72 horas. Se determinó que los mejores resultados se obtienen con 0,5ml de Optimax /g muestra, 72hs de incubación a 50°C.. Resultados Fermentación Jatropha +YNB Microorganismo: Pichia stipitis Medio: Hidrolizado de Jatropha + YNB al 1,88x JATROPHA Resultados Fermentación Jojoba +YNB Microorganismo: Picchia Stipittis Medio: Hidrolizado de Jojoba diluido 4 veces + YNB al 1,88x JOJOBA Ingeniería evolutiva Selección evolutiva Mutagénesis por UV Confirmaciones clones positivos Mutagénesis levaduras Los clones con mayor capacidad de producción de etanol, fueron utilizados en cultivos continuos (mediante pasaje a medio fresco), con concentraciones crecientes de ácido acético (desde una concentración de 3 g/l, hasta alcanzar una concentración de entre 8 y 12 g/l, según cada clon). Los pasajes y selección fueron realizados durante un periodo de 1 mes, momento en el cual no se observó más crecimiento en los cultivos. Este protocolo de crecimiento permite la selección de poblaciones más resistentes (por adaptación o por mutaciones espontáneas). UV Aquellos clones candidatos a poseer una mayor resistencia al EtOH fueron tratados con 25% EtOH durante 1 hora, y luego recuperados 1 hora en YPD, y plaqueados en YPD-agar. Se determinó la viabilidad de las levaduras mediante plaqueo y recuento de colonias. Cepas utilizadas: - Scheffersomyces stipitis Y-7124 - Saccharomyces cerevisiae Y-138 - Saccharomyces cerevisiae “Ethanol Red” (o “Fermentis”) NTG (N-metil-N’-nitroN-nitrosoguanidina) o con EMS (Etil-metilsulfonato) Las cepas de levadura Scheffersomyces stipitis Y-7124, Saccharomyces cerevisiae Y-138, y Saccharomyces cerevisiae “Ethanol Red” fueron sometidas a mutagénesis por radiación (UV) y/o química (NTG (N-metil-N’-nitroN-nitrosoguanidina) o con EMS (Etil-metilsulfonato)). En ambos casos, se determinó la dosis de radiación y la concentración de nitrosoguanidina tal que se obtuviera una viabilidad post-tratamiento de aproximadamente un 2% (estimada por número de colonias). Se pudo determinar que un cultivo en crecimiento exponencial, tratado con una concentración final de 2 mg/ml de nitrosoguanidina, durante 1 hora, se obtiene una viabilidad de entre 1% y 20%. Se observa una gran variabilidad en los resultados de mutagénesis química entre cada cepa, y poca reproducibilidad en los resultados. Este protocolo de confirmación produjo mucha variabilidad y poca reproducibilidad de los resultados. Selección clones candidatos Fermentación de melaza Las levaduras mutagenizadas fueron plaqueadas en YPD-10% EtOH. Las colonias de mayor tamaño (crecimiento más veloz), fueron seleccionadas como clones candidatos a una mayor resistencia al EtOH. Las levaduras mutagenizadas fueron seleccionadas por su capacidad diferencial de crecer en presencia de etanol (inhibe el crecimiento), tanto en medio líquido como en placas de Petri (con distintas concentraciones de etanol). Se seleccionaron las colonias que presentaran un mayor tamaño (o velocidad de crecimiento). Los clones candidatos se hicieron crecer en medio mínimo con glucosa (fuente de carbono fermentable) o glicerol (fuente de carbono respirable) para asegurarse que no hayan sufrido mutaciones no deseadas. La cepa S. stipitis Y-7124 se hizo crecer también con xilosa como fuente de carbono. Los clones positivos fueron conservados a -70ºC. Los clones obtenidos fueron analizados en cuanto a su capacidad de producir etanol, mediante fermentación de melaza de caña de azucar. Los clones seleccionados fueron colocados en Erlenmeyer de 100 ml con 80 ml de YNB + melaza como fuente de carbono. Los Erlenmeyer fueron incubados a 30ºC sin agitación durante 96 hs. Se tomaron muestras cada 24 horas. La medición de la concentración se realizó mediante un kit. Sin embargo los valores obtenidos se encontraron fuera del rango lineal para su correcta determinación. De igual forma, se pudo observar diferencias en cuanto al contenido de etanol entre los distintos clones. Estos ensayos serán repetidos, midiendo el contenido de etanol de las muestras mediante cromatografía gaseosa (GC). Por el contrario, la mutagénesis por radiación UV resultó robusta y reproducible, pudiendo determinarse una dosis de radiación de 0,2 J/cm2 para Saccharomyces cerevisiae Y-138, y Saccharomyces cerevisiae “Ethanol Red”, y de 0,4 J/cm2 para Scheffersomyces stipitis Y-7124. Ingeniería genética: metabolismo del ergosterol Reutilización de cartón tratado con celulasas para la producción de Bioetanol Comparado con otros alcanos tóxicos, tales como el decano, el etanol posee una afinidad relativamente baja por la membrana celular. Sin embargo, a altas concentraciones, el etanol se acumula ubicándose en el grupo fosfato de los fosfolípidos, afectando sus propiedades físico químicas y diversas funciones de la membrana plasmática (MP). El etanol incrementa la fluidez de la MP, altera la integridad y la función de la MP reduciendo gradualmente la viabilidad celular. En respuesta, las levaduras han desarrollado mecanismos apropiados para enfrentar diversos tipos de daños causados por el incremento de la concentración de etanol. Éstas pueden cambiar la composición de sus membranas a fin de antagonizar su fluidez y estabilizarla. Diversos estudios han sugerido recientemente que cualquier cambio en la composición de la MP de las levaduras, tendiente a incrementar la estabilidad de la misma, podría antagonizar los efectos y aumentar la tolerancia al etanol. Se ha observado particularmente que los niveles de ácidos grasos insaturados (UFAs) y el ergosterol (esterol mayoritario de las membranas de S. cerevisiae) incrementan en respuesta a altas concentraciones de etanol. El ergosterol es fundamental en la normal estructura y función de las membranas celulares, regulando el delicado balance entre los componentes de la membrana, tales como lípidos y proteínas. Estas funciones celulares esenciales sugieren que muy probablemente el ergosterol juegue un rol crítico en la resistencia al etanol en S. cerevisiae. El incremento en la rigidez de la membrana otorgada por el ergosterol antagoniza la fluidez causada por la alta concentración del etanol. Más aún, el rol del ergosterol en la tolerancia al etanol es independiente de proteínas de shock térmico (HSPs) o trehalosa, ya que la mutante con mayor tolerancia al alcohol sintetiza HSPs y acumula trehalosa a un mismo nivel que las células salvajes. 2ml de Celulasa 80 UI/ml 200 ml de buffer citrato-fosfato Se tritura en licuadora hasta obtener una mezcla homogenea La mezcla se divide en partes iguales y se coloca en Erlenmeryers de 100 lm 1 2 Incubar a 50 °C Durante 60 min Agitación vigorosa Tomar 1 ml del liquido para medir glucosa libre Inocular ambos Erlenmeyers con 2 ml de un cultivo de levaduras a una DO600= 0,2 Incubar a 30 °C Durante 96 hs Tomar 1 ml del líquido para medir el % de etanol y la glucemia libre producido en cada Erlenmeyer 1 2 Esquema de una membrana con: 1) ergosterol 2) lanosterol Si consideramos los valores máximos obtenidos de etanol para cada fermentación, obtenemos: En el método 1 (sacarificación primero y luego fermentación), se alcanza un 38% del rendimiento teórico. Por el contrario, en el método 2 (sacarificación y fermentación simultáneas), se alcanza un 65% del rendimiento teórico.