Bacterias Anaerobias Esporuladas y no Esporuladas Cátedra Microbiología General FACENA – UNNE 2017

Objetivos Conocer las principales características biológicas de los gérmenes anaerobios esporulados y no esporulados, su capacidad para producir infecciones, las posibilidades diagnósticas y las medidas profilácticas

Los procariotas y el oxígeno: Todos los procariotas presentan enzimas (Ej. Flavoproteínas) que pueden autooxidarse en presencia de O2, dando productos tóxicos: H2O2 (peróxido de hidrógeno) y O2- (superóxido) Protección frente al peróxido: Catalasa (H2O2  H2O + ½ O2) Peroxidasa (H2O2 + NADH+H+  2H2O + NAD+) Protección frente al superóxido: Superóxido dismutasa (2 O2- + 2 H+  O2 + H2O2) Aparte de las bacterias que usan O2 como aceptor terminal de electrones de sus c.t.e. respiratorias, todos los procariotas presentan algunos enzimas que pueden reaccionar directamente con este oxígeno. De estos enzimas, los más típicos son las flavoproteínas, que se pueden autooxidar en presencia de O2, dando inevitablemente peróxido de hidrógeno (H2O2), que es un compuesto muy tóxico; también se pueden generar pequeñas cantidades de otro producto tóxico, el radical superóxido (O2 -). Por lo tanto, no es de extrañar que en bacterias haya evolucionado un arsenal de enzimas para detoxificar estas sustancias:  Protección respecto de los peróxidos:  En muchas bacterias aerobias existe el enzima catalasa: H2O2  H2O + ½ O2 Algunos anaerobios aerotolerantes producen peroxidasa, capaz de eliminar cualquier peróxido, incluyendo el de hidrógeno. Las peroxidasas catalizan la oxigenación de compuestos orgánicos por el peróxido de hidrógeno, que pasa a agua: H2O2 + NADH + H+  2 H2O + NAD+ Protección respecto del superóxido: El radical superóxido se produce por acción de oxidasas y por autooxidación de quinonas, ferredoxinas y flavoproteínas. Este radical es muy tóxico, de modo que todas las bacterias aerobias y anaerobias aerotolerantes presentan el enzima superóxido dismutasa (SOD), que cataliza la conversión del superóxido en oxígeno molecular y agua oxigenada, que a su vez se destruye por los mecanismos que acabamos de ver.  

Relaciones de las bacterias con el oxígeno Aerobias: necesitan O2 para crecer Aerobias estrictas: usan O2 como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Microaerófilos: requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%) Las relaciones de las bacterias con el oxígeno dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas). Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales). Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno (en respiración anaerobia), o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno. (Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueas metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes. Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.

Anaerobias pueden crecer en ausencia de O2, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del O2, o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Estrictas: el O2 les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD ( Clostridium, arqueas metanogénicas). Aerotolerantes: presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el O2 debido a que poseen enzimas detoxificadoras. (Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). Facultativas: metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones (Enterobacterias). Las relaciones de las bacterias con el oxígeno dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos, que acabamos de estudiar. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno: Bacterias aerobias: Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química. Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas. Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas). Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales). Bacterias anaerobias: Son aquellas que pueden crecer en ausencia de oxígeno, debido a que pueden usar aceptores finales distintos del oxígeno (en respiración anaerobia), o porque poseen metabolismo estrictamente fermentativo. Anaerobias estrictas: El oxígeno les resulta tóxico ya que carecen de catalasa, peroxidasa y SOD, y por lo tanto, no pueden eliminar los productos nocivos resultantes del oxígeno. (Por ejemplo, las especies de Clostridium, y las arqueas metanogénicas). Anaerobias aerotolerantes (= aerodúricas): Al igual que las anteriores, presentan un metabolismo energético anaerobio, pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores. Ejemplos típicos son las bacterias del ácido láctico, como Streptococcus, Leuconostoc, Lactobacillus). También se les llama anaerobios indiferentes. Anaerobios facultativos: Pueden realizar metabolismo energético aerobio o anaerobio, dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones. Ejemplos son las enterobacterias como E. coli.

Crecimiento aeróbico, anaeróbico, facultativo, microaerófilo, y anaerobio aerotolerante, revelado por la posición de las colonias microbiananas (puntos negros) en tubos de medio que llevan una pequeña cantidad de agar. Se ha añadadido el indicador redox llamado resazurina, que es rosa cuando se oxida e incoloro cuando está reducido. (a) El oxígeno penetra sólo una corta distancia desde lo alto del tubo (manifestado por el color rosa), de modo que los aerobios obligados solo crecen pegados a la parte superficial.. (b) Los anaerobios, al ser sensibles al oxígeno, crecen sólo lejos de la superficie, hacia el fondo. (c) Los anaerobios facultativos, capaces de crecer en presencia y en ausencia de oxígeno crecen a lo largo del tubo, pero al tener metabolismo aerobio en presencia de oxíogeno, crecen mejor cerca de la superficie. (d) Los microaerófilos crecen un poco por debajo de la superficie, en condiciones en las que la concentración de oxígeno es inferior a la atmosférica. (e) Los anaerobios aerotolerantes crecen en todo el tubo, pero su crecimiento no es mejor cerca de la superficie (no tienen metabolismo respiratorio, sino fermentativo). Crecimiento a)aeróbico, b)anaeróbico, c)facultativo, d)microaerófilo, y e)anaerobio aerotolerante

Anaerobios No Esporulados Características generales Son incapaces de desarrollar en contacto con el oxígeno Anaerobios estrictos: requieren un 0% de oxígeno para crecer Anaerobios aerotolerantes: sobreviven hasta con 0,5% de oxígeno Son exigentes para crecer, necesitan vitaminas y cofactores. Forman parte de la flora normal del hombre y de los animales. Producen infecciones oportunistas, generalmente endógenas. Las infecciones generalmente son mixtas con bacterias aerobias. Incluyen a varios géneros de cocos y bacilos, grampositivos y gramnegativos.

Efecto tóxico del oxígeno Efecto tóxico directo Formación de anión peróxido y superóxido Oxidación de enzimas esenciales que contengan grupos SH- Inhibición del metabolismo de flavoproteínas y NADH oxidasa Imposibilidad para alcanzar potenciales redox bajos Déficit o ausencia de catalasa y/o superóxido dismutasa (enzimas presentes en aerotolerantes)

Factores de virulencia de bacterias anaerobias Capacidad de Adherencia a las células por fimbrias Proteínas de pared Polisacárido capsular Endotoxina (Lipopolisacárido) Producción de enzimas: Hialuronidasa, colagenasa, fibrinolisina, neuraminidasa, beta-lactamasa Exotoxinas Sinergismo

Flora Normal Anaerobia Cavidad oral y TRS: flora muy abundante. Las encías son un nicho muy importante. Se asocian con infecciones a nivel de cabeza y cuello. Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella, Fusobaterium nucleatum – Cocos gram-positivos Actinomyces 100:1 (ANA/AER) Piel: la flora normal se limita a los folículos pilosos. Propionibacterium acnes Peptostreptococcus Tracto genital femenino: Predominan los Lactobacillus en condiciones normales. Alteraciones hormonales y tratamientos con antibióticos alteran la flora con sobrecrecimiento de otras bacterias (vaginosis). Se asocian con aborto séptico. Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella bivia-disiens Cocos gram-positivos Lactobacillus - Clostridium Colon: hay 1.000 veces más anaerobios que aerobios. Degradan sales biliares, sintetizan vitaminas y se oponen a la colonización por otras bacterias. Se relacionan con infecciones abdominales Bacilos gram-negativos: Bacteroides grupo fragilis– Cocos gram-positivos - Clostridium, Eubacterium, Bifidobacterium 1000:1 (ANA/AER)

Recolección, transporte y conservación de muestras

Muestras aptas para cultivo anaerobios Líquidos normalmente estériles: LCR, pleural, peritoneal, etc. Muestras tomadas por punción a través de piel sana (Heridas, hematomas, colecciones, punción suprapúbica, etc.) Muestras de endometrio, pulmón, etc., tomadas por biopsia o cepillos recubiertos. Biopsias (de sitios sin flora habitual)

Muestras NO aptas para cultivo anaerobios Heces o materiales que estén contaminados con contenido intestinal (excepción C. difficile) Exudados vaginales o cervicales Orinas tomadas por micción espontánea o sonda Esputos, secreciones nasofaringeas o materiales tomados por broncoscopía sin protección.

Transporte y conservación de muestras Las muestras líquidas, purulentas y de volumen considerable pueden transportarse en tubos estériles. Las colecciones claras o de volúmenes reducidos pueden inyectarse en frasquitos con tapón de goma y atmósfera inerte, sin introducir aire. No es conveniente el sistema de transporte de muestras en jeringas, porque permite la difusión del oxígeno al interior de la muestra. Los raspados, hisopados y piezas de tejido pequeñas pueden colocarse en tubos que contengan medio de Stuart, Cary-Blair, pre-reducido. Las piezas de tejido con un volumen mayor a 1 cm3, pueden transportarse en recipientes estériles, sin conservantes.

Conclusiones Obtener las muestras en forma adecuada Protegerlas de los efectos deletéreos del oxígeno Mantenerlas a temperatura ambiente Las mejores muestras son las obtenidas de cavidades cerradas a través de tejidos no contaminados

Diagnóstico microbiológico e identificación

Diagnóstico de laboratorio Sospecha clínica Toma de Muestra Coloración de Gram Siembra en Agar sangre con y sin ATB Incubar 48 hs a 37ºC en anaerobiosis Morfología colonial y Gram Pruebas bioquímicas

Muestra Características macroscópicas: aspecto, olor, fluorescencia, etc. Observación microscópica: flora polimicrobiana, leucocitos, orienta terapia empírica, etc. Tanto en condiciones nutrientes como de atmósfera. Es dificil asignarle un rol etiológico, una significacion clinica, y a veces,

Cultivo Utilizar medios frescos, recientemente preparados o pre- reducidos Procesar rápidamente Evaluar qué microorganismos buscamos para elegir el medio: suplementos específicos

Medios Medios sólidos NO selectivos: (Agar base enriquecido: Brucella, Columbia, Schaedler, etc) Agar Base + Vit K (1 mg/ml) + Hemina (5 mg/ml) + sangre lacada al 5% (BHKA) Medios sólidos selectivos: BHKA + KAN (30 a 50 µg/ml) BHKA + VAN (5 µg/ml) Medios líquidos: Resguardo (“Backup”) Caldo BHI, tioglicolato suplementado con cisteína, Vit K y hemina.

Atmósfera Métodos para generar atmósfera anaerobia: Mezcla de gases: Se utiliza una mezcla compuesta por 5-10% H2, 5-10% CO2 y 80 a 90% de N2, Generadores comerciales: Hay diferentes sistemas comerciales: Con catalizador (Gas Pack, BBL; Anaerobic Gas generator, Oxoid): BH4Na y ácido cítrico y una tableta de HCO3Na para generar H2 y CO2 Sin catalizador: mezcla de reactivos que fijan el O2 y generan CO2. ** Activados con agua: Anaerocult, Merck; Britania. ** Activan al contacto con el aire: Anaerogen, Oxoid; Key Scientific, Mitsubishi; Genbox, Biomerieux Tanto en condiciones nutrientes como de atmósfera. Es dificil asignarle un rol etiológico, una significacion clinica, y a veces,

Atmósfera Sistemas de incubación: Jarras anaerobias Bolsas anaerobias Tanto en condiciones nutrientes como de atmósfera. Es dificil asignarle un rol etiológico, una significacion clinica, y a veces,

Cámara Anaerobia

Incubación - Controles al menos 48 hs a 35-37ºC, hasta 5 a 7 días. Atmósfera anaerobia (< 1% O2) Control de anaerobiosis Indicadores de Ox-Red: resarzurina, azul de metileno Recuperación de anaerobios estrictos: F. nucleatum, BGN pigmentados, etc. Tanto en condiciones nutrientes como de atmósfera. Es dificil asignarle un rol etiológico, una significacion clinica, y a veces,

Identificación

Colonia Procedimiento a seguir con cada colonia: Prueba de tolerancia Requerimientos culturales especiales Atmosfera (<1% O2) Nutrientes Tiempo de desarrollo Metabolismo (algunos inactivos) Procedimiento a seguir con cada colonia: Prueba de tolerancia al oxígeno (CA) (en agar chocolate en Lata con vela) Descripción macroscópica Colonia Coloración de Gram

IDENTIFICACION PRESUNTIVA Gram 1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial : Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µg Indol Bilis Nitrato Esculina Catalasa 4- Cocos gram positivos: SPS Indol Nitrato Esculina Catalasa Urea 3- Cocos gram negativos: Nitrato Fluorescencia (UV) 2- Bacilos gram positivos: No esporulados: Catalasa Indol Esporulados: Glucosa CAMP reversa Gelatina Urea Lipasa Lecitinasa Tablas Específicas

Identificación

CONCLUSIONES Buena observación micro y macroscópica Siempre hacer pruebas básicas de entrada Utilizar pruebas rápidas en spot o enzimas preformadas (inóculo alto) Asegurarse buen desarrollo en pruebas de crecimiento.

Anaerobios Esporulados

Características generales Son incapaces de desarrollar en contacto con el oxígeno Resisten hasta 120ºC, la desecación y cambios de pH Forman parte de la flora normal del hombre y de los animales. Se los encuentra ampliamente distribuidos en el agua, el suelo y las plantas Producen infecciones oportunistas. Su acción se manifiesta por la producción de potentes exotoxinas. Incluyen al género Clostridium con varias especies. Las infecciones son muy típicas y el diagnóstico generalmente es clínico.

Clasificación Neurotóxicos Clostridium tetani Clostridium botulinum Histotóxicos Clostridium perfringens Clostridium septicum Enterotóxicos Clostridium difficile

Clostridium tetani

Clostridium tetani Se encuentran en el suelo e intestino del hombre y animales. Las esporas ingresan a través de heridas. Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina. La forma vegetativa produce una exotoxina (tetanoespasmina). La toxina difunde por vía neural hasta las neuronas motoras. En SNC bloquea la liberación de glicina y GABA. A nivel periférico inhibe la liberación de acetilcolinesterasa dando como resultado la estimulación incontrolada de los músculos esqueléticos. El paciente muere por parálisis de los músculos respiratorios.

Clostridium tetani

Clostridium tetani - Prevención Se previene vacunando con el toxoide tetánico (Vacuna DPT o antitetánica sola). Se aplica a los 2, 4 y 6 meses. Primer refuerzo a los 18 meses y segundo refuerzo al ingreso escolar. Cada 10 años deben aplicarse refuerzos. La embarazada debe vacunarse al 5to y 7mo mes de embarazo. Deben lavarse perfectamente las heridas profundas, principalmente las producidas por material herrumbrado y las contaminadas con tierra o materia fecal. En caso de heridas puede emplearse profilácticamente la antitoxina, la cual se administra en forma conjunta con la vacuna.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum Se encuentran en la tierra y sedimentos acuáticos La fuente más común de intoxicación es la ingestión de conservas o fiambres caseros. Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina en el alimento y la forma vegetativa produce una exotoxina. La toxina ingresa por vía digestiva y difunde por vía humoral hasta las neuronas motoras. La toxina bloquea la liberación de acetilcolina dando como resultado una parálisis fláccida de los músculos esqueléticos. El paciente muere por parálisis de los músculos respiratorios.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum - Prevención Deben cumplirse estrictamente las normas de seguridad en la manipulación de los alimentos en la industria alimentaria. Debe educarse a la población general respecto de los procedimientos seguros de envasado de los alimentos. En caso de dudar del origen de los alimentos, deben calentarse 10 minutos a 100ºC para destruir la toxina. No debe administrarse miel a lactantes menores de 1 año de edad (Botulismo del lactante). No existe vacuna de aplicación universal.

Aplicaciones de la Toxina botulínica tipo A Indicaciones terapeúticas Espasticidad asociada con accidente cerebro vascular. Tratamiento en pacientes con parálisis cerebral Distonía cervical (tortícolis) en adultos Blefarospasmo y espasmo hemifacial Corrección del estrabismo Tratamiento focalizado de la hiperhidrosis axilar.

Corrección estética facial para remoción de arrugas. Aplicaciones de la Toxina botulínica tipo A: Botox Indicación cosmética Corrección estética facial para remoción de arrugas.

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens Se encuentran en el suelo e intestino del hombre y animales. La bacteria ingresa a través de heridas en forma endógena o exógena. Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina. La forma vegetativa produce varias exotoxinas Las toxinas difunden por contigüidad produciendo necrosis tisular y abundante cantidad de gas. La infección se manifiesta como gangrena gaseosa cuando afecta al tejido subcutáneo o como mionecrosis cuando afecta al tejido muscular Con frecuencia debe amputarse el miembro afectado.

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens - Prevención No existe vacuna de aplicación universal. Deben extremarse las medidas de asepsia durante las cirugías abdominales o al aplicar inyecciones intramusculares profundas. Deben tratarse rápidamente con antibióticos las heridas contaminadas. Cámaras hiperbáricas.