María Victoria Gómez-Gaviro1, 3 Reestructuración de la vasculatura tras el ictus: Imagen 3D del nicho neurovascular Cristina Labajo 1, 2, Teresa Lorrio1, 2, Imke Nerhoff1, Manuel Desco1, 2,3 and María Victoria Gómez-Gaviro1, 3 1 Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón. (IiSGM), Madrid, Spain. 2 Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, España. 3 Centro de Investigación Biomédica en Red de Salud Mental (CIBERSAM), Madrid, España. I. Motivación y Objetivo El ictus es la principal causa de muerte en las mujeres y de discapacidad en España, y segunda causa de muerte global de la cual no existen tratamientos efectivos. Objetivo: Observar los cambios en la vasculatura cerebral tras un ictus dada la relevancia de este factor en dicha enfermedad [1], tanto en la zona peri-infarto como en los 2 nichos de células madre (zona subventricular y giro dentado) poniendo a punto la metodología para obtener imágenes 3D usando “Single Planar Illumination Microscopy”[2]. Fig. 1. El ictus isquémico es producido por un bloqueo de las arterias causando una interrupción del flujo sanguíneo que provoca la muerte de las células nerviosas en la zona afectada. II. Material y Métodos III. Resultados MCAo (mide cerebral artery occlusion) para inducir la isquemia cerebral en ratas Wistar. Extracción del cerebro y loncheo en secciones gruesas (2-3 mm) en las zonas de interés. Clareado de las lonchas con el método “CUBIC” [3] e inmunohistoquímica de las muestras. Se marca tanto la vasculatura como las células madre/progenitoras. Desarrollo de un método para embeber la muestra en agarosa ‘low melting’. Adquisición de imagen en microscopía SPIM y procesado de las imágenes con ImageJ. Se han obtenido imágenes 3D de la zona peri-infarto y de los 2 nichos de células madre neuronales. Ha sido observada la localización de las células madre/progenitoras adyacentes a la microvasculatura y en muchos casos en las bifurcaciones de la misma. Destaca un claro aumento tanto de la densidad vascular como de las células madre/progenitoras tras el ictus. A B C D Fig. 2. Clareado de cerebro con CUBIC . Las imágenes, de izquierda a derecha, muestran la evolución del protocolo de clareado en un cerebro de ratón al inicio del proceso, después de tres y seis días de reactivo 1, respectivamente, y tras un día de reactivo 2, tras el cual se procede a la adquisicón de imagen. A B Fig. 4. Procesamiento de las imágenes obtenidas con el SPIM. A. Tinción con DAPI de los núcleos celulares que delimitan el giro dentado, zona de interés en este estudio. B. Imagen obtenida al marcar con anticuerpo DCX (marcador de precursores neuronales) en la que se puede visualizar un nicho neuronal en el hemisferio infartado que contiene un mayor número de células madre en comparación con el hemisferio sano. C. Proyección 3D del nicho de células madre localizado en el giro dentado. D. Reconstrucción 3D de la loncha a partir de las imágenes tomográficas adquiridas por microscopia SPIM. Fig. 3. Proceso de adquisición de imagen. A. Método para embeber en agarosa las lonchas gruesas en un cilindro de agarosa para una correcta adquisición de imagen en el SPIM, evitando el movimiento de la muestra durante el proceso. B. Microscopio SPIM usado para adquirir las imágenes. IV. Conclusiones La imagen 3D combinada con las técnicas de clareado de tejidos en cerebro nos proporciona información necesaria para analizar cambios estructurales que ocurren en el tejido tras un evento isquémico. Estos resultados nos pueden ayudar a comprender con más detalle la fisiología de la enfermedad. Referencias: [1] Sotomayor-Sobrino MA, Ochoa-Aguilar A, Méndez-Cuesta LA, Gómez-Acevedo C, Neuroimmunological interactions in stroke, Neurologia, 2016 Oct 21. [2]Santi PA., Light sheet fluorescence microscopy: a review, J Histochem Cytochem, 2011 Feb. [3] E. A. Susaki et al., Advanced CUBIC protocols for whole-brain and wohole-body clearing and imaging, Nature Protocols, vol. 10, no.11, 2015. Fuente de financiación: Human Frontiers Scientific Program RGP0004/2013, Red de investigación Cardiovascular (RIC), EC FP7 CIG grant HIGH THROUGHPUT TOMO, Brade, I+D Tecnologías P2013/ICE 2958 and CIBER de salud mental (CIBERSAM).