REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS

REACCIONES INMUNOLÓGICAS CLASIFICACIÓN REACCIÓN MÉTODO SISTEMA INDICADOR IF FLUOROCROMOS ELISA ENZIMAS PRIMARIAS RIA ISÓTOPOS IRMA ISÓTOPOS IN VITRO LUMINISCENCIA LUMINÓGENOS AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN FIJACIÓN DE COMPLEMENTO SECUNDARIAS ANAFILAXIA REACCIÓN DE ARTHUS IN VIVO TERCIARIAS

REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS Fuerza que facilitan la unión AG-AC: *Uniones electrostáticas * Uniones o puentes de hidrógeno * Fuerzas de Van der Waals * Fuerzas de dispersión de London

REACCIONES INMUNOLÓGICAS PRIMARIAS ELISA

Elección de una técnica inmunológica Screening? Menor número de falsos negativos Técnica sensible Confirmación? Menor número de falsos positivos Técnica específica A R Sensibilidad B Límite de detección C

Sensibilidad de las reacciones inmunológicas MÉTODO Límite de Sensibilidad detección relativa Precipitación en geles 20 1 Precipitación en medios líquidos 10 2 RFC 5 4 Aglutinación 0.4 50 HAI 0.15 133 IF 0.05 400 ELISA 0.01 2000 RIA 0.001 20000

EIA: ELISA Se basan en dos fenómenos biológicos importantes: 1.- elevada especificidad de los Ac 2.- alta actividad de algunas enzimas, lo que permite la amplificación de la señal generada por la muestra Empleo de anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Clasificación Homogéneos: fase líquida Heterogéneos: fase sólida

Y Y Y Y Y ELISA heterogéneo COMPETITIVO Determinación de Ac NO COMPETITIVO Determinación de Ag Determinación de Ac

Pasos generales de la técnica de ELISA 1.- Interacción con la fase sólida Soporte: placas de poliestireno, PVC Condiciones: 4ºC, toda la noche; 25ºC 4 h; 37ºC, 1h. SENSIBILIZACION. Buffer: carbonato-bicarbonato pH 9,6 Proteína nativa: Conserva sus epitopes configuracionales y conformacionales. Epitopes crípticos. Lavados. Etapa crítica. Separar componentes que puedan reaccionar en forma no específica, cualquiera sea la variente del método. PBS/Tween 20 (se realizarán después de cada paso)

Importancia de la optimización de la concentración del inmunorreactante en fase sólida Capacidad de saturación de la placa Inconvenientes: pérdida de inmunorreactante (formación de multicapas), competencia por los sitios Determinación de antígeno (ELISA de captura) Determinación de anticuerpo 1-10 ug/ml Ag o Ac puros 10-100 ug/ml para mezclas antigérnicas complejas

Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 2.- Bloqueo: se realiza para bloquear todos los sitios de la placa que no fueron ocupados por el antígeno. Proteína inerte para el sistema. Ej. leche descremada en PBS 7,4. Condiciones: 1h a 37ºC, 2h a temperatura ambiente, toda la noche a 4°C. Proteína inerte placa Ag

Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 3.- Reacción Ag-Ac: En un ELISA indirecto los Ac que se desean investigar provienen de fluidos biológicos (ej.: suero) el cual se pone en contacto con el Ag que está adherido a la placa. Condiciones: 1h a 37ºC o toda la noche a 4ºC. Diluyente: PBS pH 7,4, Tween 20, proteína inerte. Suero que contiene Ac contra los antígenos adheridos a la placa

Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 4.-Incubación con el conjugado: Para poner en evidencia los Ac que se encuentran unidos al Ag, se incuba con un segundo Ac que está dirigido hacia la cadena pesada del primero. Este segundo Ac se encuentra conjugado a una enzima. Ejemplo: Deseo revelar la presencia de IgGh. El segundo Ac será una anti-cadena gama humana marcado con la enzima. Enzimas más empleadas: peroxidasa, fosfatasa alcalina, ureasa, etc. Condiciones: 1h a 37°C Conjugado: Ac, dirigido contra la cadena pesada del primer Ac, marcado con la enzima.

Pasos generales de la técnica de ELISA (cont.) 5.- Revelado: en este paso se incuba con una solución de revelado que contiene el sustrato de la enzima y un cromógeno, el cual debido a la actividad enzimática sobre el sustrato induce un cambio en el estado de oxidación del cromógeno. Este último pasa de una sustancia incolora a un producto coloreado. Condiciones: 15 a 30 min a temperatura ambiente. Sustrato de revelado: sustrato de la enzima, cromógeno y buffer del sustrato.

Pasos generales de la técnica de ELISA 5.- Revelado (cont.): Cromógeno o prod. formado Ej. peroxidasa 2DH + H2O2 2 H2O + 2D Donante de hidrógeno: OPD, o-fenilendiamina 6.- Reacción de parada: agregado de H2SO4 4N

Pasos del ELISA Resultados 1. Sensibilización Revelado Lavado PBS-T 2. Incubación con la muestra 3. Incubación con el conjugado

Reacción Ag-Ac. Determinación de anticuerpos

ELISA no competitivo (tipo sandwich) Búsqueda de Ag Ac anti- TNFa marcado con enzima TNFa Ac anti- TNFa

ELISA competitivo (tipo sandwich) Búsqueda de Ag TNFa marcado con enzima TNFa de la muestra Ac anti- TNFa

Procesamiento de los datos y expresión de resultados Ensayo de ELISA cualitativo semicuantitativo cuantitativo: Curva patrón Punto de corte: X + 2 SD Sistema no competitivo Sistema competitivos Tipos de curvas patrones (análisis cuantitativo) Competitivo No competitivo R R C C

Sistemas alternativos de reconocimiento Sistema proteína/biotina (vitamina). Avidina: proteína de la clara de huevo. Estreptavidina: proteína producida por ciertas levaduras. Sistema Digoxigenina/anti-Digoxigenina (DIG/anti-DIG). Esteroide que se encuentra en forma natural sólo en dos especies de plantas del género Digitalis. Proteína A: proteína de la pared de S. aureus.

Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Peroxidasa Px Biotina Px Avidina DIG Sistema Avidina/biotina Sistema DIG/anti-DIG Peroxidasa Px Y Y Y Proteína A Y Y IgG Sistema Proteína A

Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la determinación de p24 en suero de paciente infectado con HIV suero Ac monoclonal anti-p24 Ac monoclonal anti p24-POD

1° Sensibilización de la placa con anticuerpos monoclonales anti-p24 (proteína del core de HIV) Incubación-Lavado PBS-Tween 20 0.05% 2° bloqueo con leche descremada al 1% en PBS Incubación-Lavado PBS-Tween 20 0.05% 3° Adicionar la muestra (suero de paciente infectado) Incubación 60 min a 37°C-Lavado PBS-Tween 20 0.05% 4° Adicionar el conjugado (anticuerpos monoclonales anti-p24 marcado con POD) Incubación 30 min a 37°C-Lavado PBS-Tween 20 0.05% 5° Adicionar la solución de sustrato (TMB) Incubación 30 min a 37°C Formación de un color azul verdoso 6° Adicionar solución stop (2M Ac. Sulfúrico) 7° Leer absorbancia a 450nm. Cálculos. Procesamiento de datos.

P24 (antígeno recombinante) CONTROL NEGATIVO OBJETIVO Análisis cualitativo: presencia o ausencia de p24 en suero de paciente infectado con HIV Por lo tanto necesitamos comparar con un control positivo y un control negativo. Cut-off (punto de corte) CONTROL POSITIVO A B C D REACCIÓN POSITIVA P24 (antígeno recombinante) CONTROL NEGATIVO Suero humano normal (no posee p24) El sustrato no es reducido No se evidencia color No se une el conjugado A B C D REACCIÓN NEGATIVA

S1 C(-) 3 S2 S3 S4 Muestras: S1, S2, S3, S4, S5 Controles negativos 1, 2, 3 C(-) 2 S5 C(-) 1 En el paso 3 del ELISA de captura adicionamos en diferentes pocillos las muestras y los controles NEGATIVOS

Diseño de ELISA de captura (no competitivo) para la determinación de p24 en suero de paciente infectado con HIV Suero y/o controles Ac monoclonal anti-p24 Ac monoclonal anti p24-POD

Hemos realizado un análisis cualitativo Lectura a 450 nm Realizamos el cálculo del punto de corte (cut-off) con los controles negativos Hemos realizado un análisis cualitativo Y las muestras cuya lectura supera el punto de corte son consideradas positivas Y aquellas que son inferiores al punto de corte son consideradas negativas Presencia de p24 Ausencia de p24

Chagatest- ELISA lisado SIGNIFICACION CLINICA La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria producida por el Trypanosoma cruzi. El diagnóstico de laboratorio depende del estadio en el cual se encuentre la enfermedad.

Chagatest- ELISA lisado Durante la fase aguda, se efectúa directamente mediante la comprobación de los parásitos en sangre o por métodos inmunológicos que detecten IgM. Durante la fase crónica, se pueden usar métodos inmunológicos como: hemaglutinación, inmunofluorescencia, ensayo inmunoenzimático (ELISA) o Western blot.

FUNDAMENTOS DEL METODO Chagatest ELISA lisado es un ensayo inmunoenzimático "in vitro" para la detección cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en muestras de suero o plasma humano. La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con antígenos de T. cruzi, correspondientes a zonas altamente conservadas entre distintas cepas.

Si la muestra contiene anticuerpos específicos, éstos formarán un complejo con los antígenos y permanecerán unidos a la fase sólida. La fracción no unida se elimina por lavado y luego se agrega el conjugado (anticuerpo monoclonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa), el cual reacciona específicamente con los anticuerpos anti-T. cruzi inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por lavado.

La presencia de peroxidasa unida al complejo se revela mediante el agregado del sustrato cromogénico, tetrametilbencidina. Las muestras reactivas desarrollan color celeste. La reacción enzimática se detiene mediante el agregado de ácido sulfúrico, produciendo un viraje del color celeste al amarillo. La densidad óptica se mide en forma bicromática a 450/620-650 nm o a 450 nm

INMUNOFLUORESCENCIA Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos microbianos en tejidos. Coons AH,Creech HJ, Jones RN: Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: 200-202. Actualmente es un método empleado para demostrar antígenos celulares y tisulares o anticuerpos en fluidos biológicos provenientes de numerosas condiciones clínicas humanas, animales y experimentales.

INMUNOFLUORESCENCIA Técnica relativamente poco costosa, rápida, simple, altamente sensible y confiable. Desarrollada originalmente por Coons y col (1942). Demostró antígenos microbianos en tejidos. Ahora es un método usado para demostrar muchos otros antígenos celulares y tisulares en numerosas condiciones clínicas humanas y animales. Identificación de microorganismos en materiales infectados (agentes infectivos en materiales sospechosos) Identificación de reacciones antígeno-anticuerpo desarrolladas con cantidades mínimas de reactivos. Identificación de células comprometidas en la biosíntesis de anticuerpos

Sensibilidad de las reacciones inmunológicas MÉTODO Límite de Sensibilidad detección relativa Precipitación en geles 20 1 Precipitación en medios líquidos 10 2 RFC 5 4 Aglutinación 0.4 50 HAI 0.15 133 IF 0.05 400 ELISA 0.01 2000 RIA 0.001 20000

INMUNOFLUORESCENCIA Fundamento Empleo de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes o fluorocromos Fluorocromo Excitación Emisión Tiempo Fluorescencia máx(nm) máx(nm) declin.(nseg) Isotiocianato de fluoresceína 495 525 4.5 verde (FITC) de rodamina 550 585 3.0 anaranjado-rojiza (TRICT)

Incubación con anticuerpos anti- marcador, no conjugado PASOS GENERALES IFD IFI Preparación de una impronta, corte tisular o frotis; suspención celular Fijación Incubación con anticuerpos anti- marcador, conjugado con un fluorocromo Incubación con anticuerpos anti- marcador, no conjugado Lavados con solución salina tamponada Incubación con segundo anticuerpos anti- primer Ac, conjugado con un fluorocromo Observación entre porta y cubre Montaje y observación Lavado Observación

Fundamentos Empleo de anticuerpos marcados conjugados con sustancias fluorescentes o fluorocromos F

Fluorescencia 1°: Excitación: se entrega un fotón de energía por una fuente externa a un fluoróforo que absorbe, pasando a un estado electrónico excitado S1’ Diagrama Jablonski 2°: Duración del estado excitado: existe por un período de tiempo finito donde el fluorocromo, sufre cambios conformacionales. En consecuencia la energía de S1’ es parcialmente disipada produciendo un estado excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia. 3°: Emisión de fluorescencia: un fotón se emite, lo que permite el retorno al fluoróforo al nivel S0.

INMUNOFLUORESCENCIA  excitación  detección Intensidad de luz Absorción de luz Emisión de luz Longitud de onda Fig 1. Principio de medición de la fluorescencia.

Alexa Fluor Alexa Fluor® dye Absorption  max. (nm) Emission  max (nm) Emission color* Extinction  coefficient** Alexa Fluor® 350 346 442 Blue 19,000 Alexa Fluor® 405 401 421 34,000 Alexa Fluor® 430 433 541 Green/Yellow 16,000 Alexa Fluor® 488 496 519 Green 71,000 Alexa Fluor® 532 532 553 Yellow 81,000 Alexa Fluor® 546 556 573 Orange 104,000 Alexa Fluor® 555 555 565 150,000 Alexa Fluor® 568 578 603 Orange/Red 91,000 Alexa Fluor® 594 590 617 Red 73,000 Alexa Fluor® 610 612 628 138,000 Alexa Fluor® 633 632 647 Far Red 239,000 Alexa Fluor® 635 633 140,000 Compuestos orgánicos sintéticos que proporcionan una señal de fluorescencia más intensa y estable que los flourocromos convencionales Invitrogen

Importante Las reacciones de IF ponen en evidencia o demuestran la presencia de antígenos que se encuentran expresados sobre estructuras las cuales reciben el nombre de improntas Bacterias Parásitos Células Tejidos

Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y INMUNOFLUORESCENCIA Ac-fluorocromo Anticuerpo INDIRECTA amplificada por complemento DIRECTA INDIRECTA Ac-fluorocromo Anticuerpo Y Y Corte de tejido Y Lavar Lavar Lavar Complemento Ac-anti Ig fluorocromo Y Y Y Y Lavar Ac-anti C3 fluorocromo Lavar Y Y Y Lavar

Clasificación Inmunofluorescencia Inmunoflorescencia Directa (IFD) Impronta Ag de interés

Inmunoflorescencia Indirecta (IFI) Impronta Ag de interés

Ventajas y desventajas Inmunofluorescencia directa Inmunofluorescencia indirecta Utiliza un solo anticuerpo Utiliza un 2° anticuerpo conjugado Anticuerpo 2° Anticuerpo 1° Anticuerpo 1° Antígenos Antígenos Ventajas y desventajas Se realiza en una etapa Alta especificidad con menos problemas de background Baja sensibilidad Se realiza en más de una etapa El mismo anticuerpo conjugado se utiliza para distintas reacciones. Baja especificidad Alta sensibilidad

Incubación con el anticuerpo PASOS GENERALES Preparación de una impronta, corte tisular o frotis; suspensión celular Fijación Incubación con el anticuerpo IFD IFI

El anticuerpo esta marcado con un florocromo. IFD IFI El anticuerpo esta marcado con un florocromo. El anticuerpo NO ESTA marcado con un florocromo. Lavado con Solución salina Lavado con Solución salina Incubación con segundo anticuerpos anti- primer Ac, marcado con un fluorocromo Montaje y Observación Lavado con Solución salina

SISTEMA PARA LA VISUALIZACIÓN DE LA INMUNOFLUORESCENCIA FUENTE: lámparas que emiten radiaciones ultravioletas (xenón, halógenas y de mercurio a altas presiones) FITRO DE EXCITACIÓN: selecciona la logitud de onda que incidirá en la impronta ( máxima de absorción del fluorocromo) FILTRO BARRERA: que se coloca entre el ocular y la impronta (eliminación de las radiaciones dañinas y radiaciones de fondo)

SISTEMA DE MICROSCOPIOS EPI-ILUMINACIÓN TRANS-ILUMINACIÓN

Microscopio confocal

APLICACIONES Y EJEMPLOS DE LA IF

APLICACIONES IFD: búsqueda de antígenos en cortes de tejido, en la superficie de microorganismos, identificación de poblaciones celulares, etc. IFI: búsqueda de anticuerpos en líquidos biológicos, análisis de autoanticuerpos circulantes (enfermedades autoinmunes). IFI amplificada por el complemento: detección de anticuerpos fijadores de complemento específicos para el antígeno fijado en la impronta. IF de tinción doble: evidenciar la presencia de dos antígenos sobre la misma impronta con el empleo de dos tipos de anticuerpos marcados con dos fluorocromos distintos cuyas  de emisión están separadas entre sí.

IF Directa Aplicación: búsqueda de antígenos en cortes de tejido, microorganismos, identificación de poblaciones celulares, etc.

Identificación de Linfocito B por IF Observación, por microscopía de fluorescencia, de las inmunoglobulinas de superficie de un linfocito B Esquema de la técnica para la observación de las inmunoglobulinas de superficie de un linfocito B. Un suero policlonal o monoclonal (a) marcado con isocianato de fluoresceína (b) reacciona con las inmunoglobulinas de la membrana.

Detección del receptor de factor de crecimiento epidermal en biopsia de un tumor humano Ac anti-EGF marcado con Alexa Fluor 488.

IF de tinción doble Aplicación: evidenciar la presencia de dos antígenos sobre la misma impronta con el empleo de dos tipos de anticuerpos marcados con dos fluorocromos distintos cuyas  de emisión están separadas entre sí.

Visualización de filamentos de actina en Tetrahymena thermophila y celulas endoteliales de arteria pulmonar bovina Ac anti-tubulina marcado con Texas Red. Ac anti-tubulina marcado con Alexa Fluor 488.

Visualización de filamentos de actina y mitocondrias en fibroblastos Ac anti-tubulina marcado con Alexa Fluor 350, anti proteína inhibidora del complejo V marcado con Alexa Fluor 500.

Procesamiento e información de resultados Generalmente en IFD el objetivo es evidenciar la presencia o ausencia de un Ag de interés. En la mayoría de los casos la muestra problema es comparada con una que contiene el Ag de interés (CONTROL +) y otra que no lo contiene (CONTROL -) Resultado cualitativo

IF Indirecta Aplicación: la IFI puede ser empleada con los mismos propósitos que la IFD. Sin embrago, tiene gran aplicación en el laboratorio clínico para demostrar la presencia de anticuerpos en líquidos biológicos en un amplio número de patologías.

Células infectadas con el virus de la peste porcina africana Técnica de IFI. Células MS infectadas con el virus de la peste porcina africana. Se puede observar como los anticuerpos se han unido a la células infectadas, destacándose en el citoplasma unas zonas con una intensidad mayor, que corresponden a zonas de mayor replicación viral, y por tanto mayor fijación de anticuerpos.

Detección de células germinales en ovario de ratón Ac 1º anti PGC7 (conejo) , Ac 2º anti IgG de conejo marcado con Alexa Fluor 488

Prueba de inmunofluorescencia de Crithidia luciae para anticuerpos hacia el DNA . Prueba diagnóstica en LES.

Determinación de Ac anti-citoplasma de Neutrófilos (ANCA) en suero de paciente con Vasculitis Sistémica Impronta con Neutrofilos Suero Paciente Control (-) Ac 2º Ig anti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC

Patrón de IFI de un suero obtenido de un paciente con AC anti-T. cruzi Ac 2º Iganti-inmunoglobulinas humanas marcado con FITC

Como informar un título de AC por IF? 1/2 1/4 1/8 1/16 C - C + Impronta con T. cruzi fijados

El título de la muestra será la última dilución que de fluorescencia positiva

Procesamiento e información de resultados En el caso de una IFI puedo procesar los resultados de manera cualitativa. Sin embargo, en el caso que el objetivo sea determinar el titulo de Ac de una muestra debo emplear un método semicuantitativo. Resultado cualitativo y semicuantitativo.

Procesamiento de los datos Cualitativa. Presencia y ausencia. Controles negativos y positivos Semicuantitativa. Informar título. Controles negativos y positivos

Citometría de flujo