ENZIMOLOGÍA DIGNÓSTICA Docente: Dra Telma Brich INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD FUNDACIÓN HÉCTOR A. BARCELÓ CARRERA DE TÉCNICOS EN ANÁLISIS CLÍNICOS ASIGNATURA: ANÁLISIS CLÍNICOS II ENZIMOLOGÍA DIGNÓSTICA Docente: Dra Telma Brich

Las enzimas están en el centro de cada proceso bioquímico. Actúan en secuencias organizadas . Catalizan cientos de reacciones consecutivas (degradan nutrientes, se conserva y transforma la energía química y se fabrican las macromoléculas biológicas) Reguladoras las rutas metabólicas.

Todas las enzimas son proteínas(excepcionalmente las ribozimas). La actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa (las estructuras primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias de las proteínas enzimáticas son esenciales  para su actividad catalítica)  

Propiedades Catalizadores biológicos: aceleran la velocidad de las reacciones bioquímicas, sin ser alteradas químicamente ni consumidas. Disminuyen la energía de activación

Estructura Interacción precisa enzima-sustrato (controlan las reacciones bioquímicas ofreciendo un entorno tridimensional a los reactivos sobre los que actúan).  Sitio de interacción: Sitio Activo (Sustrato y sitio activo tienen formas complementarias)

Estructura COENZIMA: Moléculas pequeñas derivadas de las vitaminas. No es una proteína, se une transitoriamente durante la reacción. NAD-COA-TTP APOENZIMA: Porción Proteica ACTIVADORES: Iones metálicos: Ca2+ Mg2+ Zn2+

Cinética enzimática

Cinética enzimática REPRESENTACION ECUACION DE MICHAELIS MENTEN LINEALIZACION DE LA ECUACION

Factores que alteran la actividad enzimatica Sustrato Inhibidores Activadores Temperatura pH Fuerza iónica Concentración de proteínas

Los sucesivos congelamientos y descongelamientos de una muestra producen alteración de la actividad catalítica de una enzima debido a: Alteración del sitio activo. Alteración en su comportamiento inmunológico. La presencia de un quelante de calcio en la muestra (anticoagulante) produce: Disminución de la actividad enzimática. Alteración de la estructura terciaria de la enzima.

La cinética enzimática debe ser Dependiente de la concentración de sustrato Independiente de la concentración de sustrato. Un aumento de la temperatura en + 3°C en una metodología de valoración enzimática produce resultados falsamente: Aumentados Disminuidos

Clasificación según origen Enzimas de secreción :Se producen en glándulas exócrinas, como páncreas y próstata, así como en tejidos como mucosa gástrica y hueso. En ciertas condiciones patológicas su aumento puede ser asociada a su sitio de origen. Ej: En adenocarcinoma y osteosarcoma se observa un aumento importante de la actividad plasmática de las fosfatasas ácida y alcalina.

Clasificación según origen Enzimas del metabolismo intermedio Concentración tisular>>>>> Concentración plasmática Un aumento en la permeabilidad de la membrana plasmática por lesión de las células parenquimatosas de un órgano por un proceso patológico puede producir liberación a la circulación general de estas enzimas. Patognomónicas: Indicadoras de enfermedad Ej: Aspartato amino transferasa (AST o GOT) Lactato deshidrogenada (LDH) [ENZIMA]→ VALOR DIAGNOSTICO Y/O PRONOSTICO

Clasificación según función Funcionales :tienen una función definida y específica en el plasma y su concentración plasmática es equivalente o mayor que la del tejido donde se producen. Ej. Seudocolinesterasa Ceruloplasmina Lipoproteinlipasa Enzimas que intervienen en la coagulación. La determinación de la actividad de estas enzimas tiene interés clínico en le evaluación tanto de la función propia de la enzima en el estudio como de la función del tejido que la sintetiza.

Clasificación según función No funcionales : No tienen una función conocida en el plasma ( no dispone de la cantidad necesaria de sustratos, cofactores o activadores a nivel plasmático porque su concentración plasmática es menor que los niveles titulares. Normalmente existen niveles circulantes detectables de la mayoría de las enzimas no funcionales debido a la renovación celular natural o pequeños traumatismos espontáneos. Su presencia en plasma en niveles más altos de lo normal sugiere un aumento en la velocidad de destrucción celular y tisular.

Moduladores de la actividad enzimática Reversible (transitoria) o Irreversible (permanente) Competitivos: compiten con el sustrato por el sitio catalítico de la enzima, su efecto en la cinética es aumentar el valor de Km. No competitivos :se unen a un sitio de la enzima diferente del sitio catalítico, o eliminan un cofactor necesario para la enzima. Su efecto cinético es disminuir la Vmax, porque reducen la capacidad de la enzima para transformar el sustrato en producto. Acompetitivos son raros, actúan uniéndose al complejo E-S e impidiendo su disociación. El efecto cinético es disminuir tanto Km como Vmax.  

Por ejemplo, la aspirina o ácido acetilsalicílico inhíbe irreversiblemente la acción de la sintetasa de prostaglandina: Algunas prostaglandinas producen dolor e inflamación. Al quedar bloqueada su síntesis se reduce la inflamación y se alivia el dolor.

Marcadores Bioquímicos Los biomarcadores son sustancias que se encuentran en el suero y su medición es indicador de un proceso biológico normal o patológico. Tejido específico →Indican daño tisular Isoenzimas: formas de la misma enzima, estructuralmente diferentes, que catalizan la misma reacción. Difieren en propiedades cinéticas o parámetros de regulación. Cada isoenzima se encuentra en mayor proporción en un órgano o tejido específico, característica que se utiliza para identificar el tejido dañado que libera la enzima al plasma.

Isoenzimas Creatin Quinasa ( CK ): Es una enzima citoplasmática y mitocondrial ampliamente distribuida por los tejidos, pero en forma decreciente en músculo esquelético, músculo cardíaco, placenta, cerebro y otros tejidos. La Isoenzima CK-MM predomina en el músculo esquelético, en el miocardio también predomina la CK-MM pero hay entre un 13-22% de CK-MB. En el cerebro hay un 100% de CK-BB.

Marcadores bioquímicos El biomarcador ideal reúne las siguientes características: Está ausente o con valores constante en ausencia de daño. Aumenta su concentración en forma correlativa con el grado de daño. Es específico de un órgano o tejido.  

Enzimas de metabolismo intermedio: El aumento de su concentración en plasma indica una lesión a nivel tisular. Se producen por glándulas exócrinas como el páncreas. Un inhibidor competitivo: Elimina un cofactor necesario para la enzima. Compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima

Las isoenzimas de una determinada enzima son: Inmunológicamente iguales. Indicadoras de daño órgano específicas. Una característica de un biomarcador es: Específico de un órgano. No aumenta su concentración proporcionalmente al daño.

Mapa enzimático El mapa enzimático tisular está constituido, por la cantidad de cada una de las distintas enzimas que contienen todas las células de un determinado órgano. Es la descripción de un órgano en términos de su contenido enzimático.   La medida de los diversos mapas enzimáticos séricos, por su parte, constituye el intento de lograr la especificidad bioquímica de los diferentes órganos. Cuando un órgano se lesiona, el mapa enzimático sérico es una reproducción de su modelo enzimático tisular normal. El interés clínico se centra en el estudio de aquellas cuyas variaciones son patognomónicas. Se determinan más de una enzima en el suero, por el hecho de no existir enzimas que sean simultáneamente órganoespecíficas y lo suficientemente sensibles.

Clasificación de enzimas el proceso que catalizan CLASE I: Oxidorreductasas (Catalizan reacción REDOX) CLASE II: Transferasas (Catalizan la transferencia de grupos funcionales que contengan C,N,P de un compuesto donante a otro receptor) CLASE III: Hidrolasas (Catalizan reacciones de hidrólisis) CLASE IV: Liasas (catalizan reacciones reversibles de adición de un grupo a un doble enlace) CLASE V: Isomerasas (catalizan la reorganización de la estructura de un sustrato sin modificar la formula empirica) CLASE IV: Ligasas (catalizan reacciones de unión de sustrato que necesitan energía aportada por ATP, GTP.

Interés clínico En procesos inflamatorios aparecen en plasma en primer término enzimas de bajo e intermedio peso molecular. En nivel de enzimas en el suero que se observa en una lesión es generalmente proporcional a la magnitud de membrana celular afectada. En los daños celulares mínimos, primero pasan a la sangre las enzimas citoplasmáticas y en caso de daño extenso o más intenso, lo hacen las enzimas localizadas en las membranas de las organelas . Hay factores que alteran la permeabilidad selectiva de la membrana celular y que provocan una salida al espacio extracelular de enzimas intracelulares (Hipoxia- Drogas) Para los fines diagnostico, una elevación de las enzimas celulares en el plasma es equiparable a una lesión celular.

Determinación de niveles séricos de enzimas Demostrar in vitro la actividad catalítica que un enzima tiene in vivo→ Funcionalidad La actividad enzimática se mide mediante determinación de la cantidad de sustrato transformado por unidad de tiempo en condiciones precisas de temperatura, pH, etc. Aumento de uno de los productos Descenso de la concentración del sustrato Índice de cambio en la concentración de la coenzima como medida del índice de reacción.

Aspectos prácticos: Condiciones de la muestra e Instrumentales

Unidades de medida Las unidades en las que se miden las enzimas son Katal / L. 1Katal = 1 mol de sustrato catalizado por segundo. Las UI/ L se definen como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1mol de sustrato o coenzima por minuto en las condiciones de la prueba. ( 1UI = 16,7 nK (nanokatales).)

Determinación de niveles séricos de enzimas LDH Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD+  La velocidad de desaparición del sustrato es proporcional a la cantidad de enzima LDH presente en la muestra.

Determinación de niveles séricos de enzimas GPT Alanina +α-cetoglutarato → piruvato + glutamato   GPT (fosfato de piridoxal) Alanina + α-cetoglutarato → Piruvato + glutamato LDH Piruvato + NADH + H + → Lactato + NAD+ Ni sustratos ni los productos absorben luz en el rango UV o visible, por lo cual la determinación de las transaminasas se realiza través de una reacción acoplada que utiliza como sustrato un producto de la reacción anterior.

La determinación de la actividad enzimática se realiza a partir de: Determinación de aumento de sustratos. Cambio en la concentración del cofactor. La hemólisis en una muestra conduce a errores en la valoración enzimática debido a : Interferencia en la reacción colorimétrica. Ruptura de células y escape de enzimas celulares.

Unidades de medida de la velocidad enzimática: UI/L mUI/ml Mg/dl La metodología para la determinación de enzimas: Imita in vitro la reacción que realiza in vivo. Realiza determinaciones de acople para obtener una señal medible. Utiliza sustratos que producen productos que pueden medirse colorimétricamente.

Valoración de resultados Enzimas cardíacas Infarto de miocardio: Es la muerte de parte de las células del músculo cardíaco que se produce secundaria a una isquemia (falta de riego sanguíneo). Criterios aceptados de diagnóstico de infarto agudo de miocardio (IAM) :requiere la presencia de dos de los tres siguientes criterios: dolor torácico nuevos cambios en el ECG aumento y disminución característica de los biomarcadores cardíacos.

Enzimas cardíacas: Biomarcadores Mioglobina Troponinas cardíacas (TnI-TnT) Creatin kinasa (CK_CPK) Creatin kinasa MB Aspartato amino transferasa (GOT-AST) Lactato deshidrogenasa Isoenzima LDH 1 (Suero) Isoenzima LDH 2 (Miocardio)

Mioglobina Es una proteína compuesta por una cadena polipeptídica y un grupo prostético Hemo (es una Holoproteina)que está presente en todas las fibras del músculo estriado. Es un marcador no enzimático No es cardioespecífica Es el primer marcador que se eleva después del daño celular miocárdico.(2- 3 hs) Union de o2 a mioglobian es no cooperativa. Diferente curva de disociación con hemoglobina

Troponinas Complejo troponina : 3 subunidades diferentes: troponina C (proteína de unión al calcio) troponina T(proteína de unión a la tropomiosina) troponina I (proteína inhibidora). Regulan la interacción de la actina con la miosina en el músculo estriado durante el fenómeno de contracción-relajación muscular. No detectable en condiciones normales (<0,05 ng/ml) Aumenta a las 3 a 7 horas de producido el evento y se mantienen por encima de los valores normales de 7 a 14 días. → diagnóstico retrospectivo. 

Creatin kinasa (CK o CPK) La función de la CK en músculo es contribuir al almacenamiento de energía en forma de creatina fosfato usando ATP y creatina como sustratos CK Creatina –P + ADP ↔ Creatina + ATP (Cofactor Magnesio)  Isoenzimas Músculo esquelético :CK-MB : 0 al 6% de la CK total. Corazón normal : CK-MB: 15 y el 20% de la CK total. La CK-BB es la dominante en cerebro y músculo liso. Marcador de daño cardíaco.

Metodología CK Fosfato de creatina + ADP → creatina +ATP HK ATP + D-glucosa → ADP + G6P G 6 PDH G6P + NADP+ → D 6 fosfogluconato + NADPH + H+ Reacción enzimática cinética acoplada. La velocidad de formación de NADPH es directamente proporcional a la actividad catalítica de la CK y se determina midiendo el aumento de absorbancia fotométricamente a 340 nm.

Isoenzimas CK   Las tres isoenzimas se encuentran en el citosol celular o asociada con estructuras miofibrilares. Ventaja de la CK-MB sobre la CK Total : mejor especificidad de órgano. Necrosis miocárdica → liberación de CK-MM y CK-MB la sangre. La CK-MB aumenta a las 3 a 6 horas tras el inicio de los síntomas de IAM y el máximo se alcanza entre las 12 y 24 horas. Variables pre-analíticas: Cirugía cardíaca, miocarditis y la cardioversión eléctrica, cateterización coronaria, anginas de pecho elevan los niveles séricos de la isoenzima MB.

Metodología Isoenzimas CK Métodos no inmunológicos:  Electroforesis: Técnica semicuantitativa .Poco práctica.    Métodos inmunológicos: A)Inmunoinhibición: CK-MB actividad. Método inmunológico indirecto.  Permite medir la actividad de la subunidad B de la isoenzima MB, después del bloqueo específico de las subunidades M (de MM y de MB) por un anticuerpo específico. La actividad residual, después de la inmunoinhibición, corresponde a la MITAD de la isoenzima MB. Interferencia por hemolisis. B)Métodos basados en la medición de masa: Técnicas radioinmunológicas: IRMA Técnicas enzimoinmunológicas (CK-MB masa): Detección mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos. No hay interferencia por hemolisis. Determinación automatizada, rápida y adaptable al Laboratorio de Urgencias →método de elección.

Lactico dehidrogenasa (LDH)    Enzima oxido reductasa (Metabolismo energético anaerobio) LDH  Piruvato + NADH -  +  H+    ↔    Lactato   +   NAD+ La velocidad de disminución de NADH se mide fotométricamente y es directamente proporcional a la actividad de la LDH en la muestra o control. Sus isoenzimas conocidas son: LD1, LD2, LD3, LD4, LD5.   Para la dosaje de las isoenzimas se pueden utilizar electroforesis o métodos inmunológicos.  

Aspartato aminotranasferasa (GOT-AST) Enzima de localización mitocondrial y citoplasmática . No es órgano específica. No detección precoz. GOT 2oxoglutarato   +   Laspartato    ↔    Glutamato   +   Oxalacetato                                                          MDH  Oxalacetato   +   NADH ¯   +   H+    ↔    Malato   +   NAD+

IAM El ascenso característico de los Biomarcadores se produce en todos los enfermos con IAM clínicamente (ECG con onda Q) demostrado. Para confirmar el Diagnóstico de Certeza de Necrosis Miocárdica, los Marcadores Séricos Cardíacos deben medirse en el momento del ingreso del paciente en el Centro Hospitalario, a las 2 horas, a las 4 horas, a las 6 horas, a las 9 horas después y, de nuevo, a las 12 y 24 horas del ingreso sí el diagnóstico sigue siendo dudoso.

La determinación de troponina… Por sí sola determina IAM. Es un marcador precoz y sensible de IAM. La metodología de elección para la determinación de CKMB en una guardia es: Electroforesis Inmunocromatografía El biomarcador enzimático más específico en IAM es: GOT CKMB TROPONINA

Páncreas Páncreas: Glándula endócrina y exócrina

Enzimas pancreáticas: Amilasa Enzima HIDROLASA . Cataliza reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 de la alfa amilasa en el proceso de digestión de glucógeno y almidón. Isoenzimas P y S. Activador: ión calcio. Método colorimétrico- fotométrico incremento en absorbancia a 405 nm es proporcional a la cantidad de α-amilasa en la muestra. CNPG3 (2-cloro-p-nitrofenil- α-D-maltotriosido) -- α-Amilasa → 2-Cloro-p-nitrofenol ".

Enzimas pancreáticas: Lipasa Enzima HIDROLASA Cofactor: colipasa. Cataliza la hidrólisis de triacilglicerol a 1-2 diacilglicerol y ácidos grasos. El páncreas constituye el principal origen de la lipasa sérica (mamaria, gástrica). Se filtra por glomérulo y se reabsorbe por los túbulos; la amilasa no se reabsorbe. Mayor sensibilidad y mayor especificidad que amilasa (siempre que se agregue el cofactor a la metodología) Permanece en suero más tiempo elevada. Metodología más costosa que amilasa. No informan gravedad de la patología. Complementan el diagnóstico por imágenes.

Interpretación de resultados Diagnóstico de pancreatitis aguda. Autolisis (Activación de proenzimas por la tripsina) Persistencia de valores aumentados: necrosis Origen: Obstrucción (litiasis biliar) Alcoholismo Trauma Fármacos (tóxicas) Idiopático Metabolismo Valores aumentados: Carcinoma hepático. Colecistitis.Trasplante renal. Hepatitis viral Cetoacidosis diabética. Cáncer de pulmón 20% pancreatitis cursan con Amilasa dentro de valores normales

Hígado Glucogenolisis- Gluconeogénesis Síntesis de ácidos grasos (AG) ,formación de lipoproteínas, colesterol y fosfolípidos. Síntesis de proteínas plasmáticas, conversión y desaminación de aminoácidos y formación de urea. Metabolismo y almacenamiento de vitaminas. Síntesis, liberación y degradación factores de coagulación. Catabolismo y excreción de hormonas. Detoxificación de sustancias endógenas (Bilirrubina) y exógenas (fármacos) Formación de bilis:

GOT FAL GGT GPT GOT

Valoración del estado hepático Pruebas de laboratorio Función hepática (Disminución masa funcional) Metabolismo de Proteínas y aminoácidos Metabolismo de lípidos Metabolismo de hidratos de carbono Marcadores del daño Enzimas hepatocelulares (Liberadas X daño hepático. Marcadores de permeabilidad).GOT-GPT-LDH-GDH-SDH-OCT Enzimas biliares (Inducidas o secretadas por hepatocitos) (Colestasis). GGT-FAL. Pronóstico

Transaminasa glutámico-pirúvica (ALT o GPT) Enzima Amino transferasa Cofactor: Fosfato de piridoxal Elevación en plasma por escape. Vida media corta : 18 hs No proporcional a la cantidad de hepatocitos dañados Necrosis Inflamación Alteración permeabilidad de la membrana Inducción medicamentosa Neoplasias

Transaminasa glutámicooxalacética (AST o GOT) Enzima Aminotransferasa Cofactor Fosfato de piridoxal Origen: Citoplasmática y mitocondrial. Vida media 18 hs ( persistencia indica lesiones persistentes o profundas) Incremento> influencia por necrosis (escape) Se encuentra: Tej. Cardíaco,Esquelético,Eritocitos, cerebro y riñon. Aumento paralelo a ALT Inflamación (↑ leve)/ Necrosis o inducción medicamentosa (↑↑↑)

FOSFATASA ALCALINA (FAL) Enzima hidrolasa: desfosforilación. No es órgano específica: Hígado, riñón, hueso, placenta, intestino. Se encuentra en la membrana de las células de los canalículos biliares . Facilita el movimiento de sustancias a través de las membranas celulares. Los osteoblastos producen la FAL ósea. (Mineralización). Cofactor: fosfato de piridoxal. Activador: Zn++ Secretada en bilis y se libera en respuesta a colestasis o inducción farmacológica. Liberación retrasada pero sostenible en el tiempo. (Se tiene que sintetizar)

Valores elevados: Obstrucción biliar Enfermedad ósea Consolidación de una fractura Hepatitis Hiperparatiroidismo Esteatosis hepática. Enfermedad hepática Cánceres óseos osteoblásticos Osteomalacia Enfermedad de Paget En situaciones fisiólogicas: En niños durante la etapa de crecimiento Embarazos

Metodología Fosfato de p-nitrofenilo + H2O ——FAL—————→ p-Nitrofenol + HPO4 2– + 2H+   El incremento en la absorbancia de la mezcla de reacción a 415 nm debido a la formación del p-nitrofenol, es proporcional a la actividad de la fosfatasa alcalina

GAMMAGLUTAMILTRANSPEPTIDASA (GGT) Enzima glucoproteica transferasa. (5-L-glutamil)-péptido + aminoácido ------GGT---------→ - péptido + 5-L-glutamil) Origen: microsomal unida a membrana plasmática del lado canalicular. Aumenta paralelamente con ALP Hepatitis alcohólica Cirrosis Metástasis de hígado Colestasis intrahepática Obstrucción extrahepática Hepatitis crónica Cáncer hepático primario Esteatosis alcholica / no alcoholica

Metodología Lσ glutamil 3 carboxi 4 nitranilida + glicilglicina --GGT----------------------------→ lσ glutamilglicinglicina + 5 amino 2 nitrobenzoato Método enzimático cinético colorimétrico, medición fotométrica .  

Hepatograma Bilirrubina total y directa. (BT, BD) Transaminasas ( AST, ALT) Fosfatasa alcalina (FAL) Gama-glutamil transferasa (GGT) Concentración de protrombina (TP) Proteínas totales Albúmina

Verdadero /Falso La determinación de valores aumentados de amilasa por sí sola es diagnóstico de pancreatitis. La disminución de urea podría indicar función hepática disminuida. El aumento de fosfatasa alcalina es debido a una colestasis hepática. Aumento de GOT y GPT indican escape de enzimas por daño hepático. La ubicación celular de la GGT es mitocondrial.