DIAGNÓSTICO PRENATAL ISABEL CASTRO VOLIO UNIVERSIDAD DE COSTA RICA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN SALUD INISA 2010

Enfermedades genéticas Situación actual en el mundo: diagnóstico tratamiento prevención

Prevención de enf. genéticas Primaria  Secundaria  Terciaria

Opciones reproductoras para portadores de enf. genéticas 1. Antes del matrimonio: no casarse casarse normalmente no casarse con otra persona portadora. 2. Después del matrimonio no procrear correr el riesgo procrear si hay diagnóstico prenatal procrear con una tercera persona divorciarse

Antecedentes El diagnóstico prenatal citogenético se ha ofrecido a las embarazadas de los países desarrollados durante los últimos 40 años. Las indicaciones que conducen a un test invasivo como amniocentesis o biopsia de corion se dirigen hacia las mujeres que, después del tamizaje, se encuentra que tienen un riesgo aumentado de que su feto tenga cromosomopatía, principalmente aquellos con síndrome de Down. Al principio, el tamizaje se basaba en la edad de la embarazada y el riesgo consecuente de trisomía fetal. Durante los últimos 20 años, los programas de tamizaje han utilizado además otras técnicas, tales como marcadores bioquímicos en el suero materno y marcadores sonográficos de aneuploidía, tanto en el primer como en el segundo trimestre de gestación.

Indicaciones de dx prenatal citogenético Edad materna igual o mayor que 35 años, Padre / madre portador reacomodo cromosómico, Cromosomopatía en un producto anterior, Ultrasonograma anormal, Marcadores séricos  tamizaje positiva, Marcadores sonográficos  riesgo aumentado de cromosomopatía fetal.

EL RIESGO DE SÍNDROME DE DOWN ES DEPENDIENTE DE LA EDAD DE LA EMBARAZADA

Diagnóstico prenatal en general, indicaciones Edad materna avanzada Aborto habitual ( 3) Historia familiar de enfermedad genética mendeliana o multifactorial conocida o sospechada Riesgo aumentado de enfermedad genética por etnia, religión… Teratógeno Hallazgos ecográficos anormales Resultados anormales del tamizaje en suero materno.

Técnicas de diagnóstico prenatal NO INVASIVAS Ultrasonografía Dopplersonografía Tamizaje prenatal con marcadores bioquímicos Células fetales en la circulación materna ADN fetal libre en el plasma materno Resonancia magnética fetal ultra rápida. INVASIVAS amniocentesis biopsia de corion cordocentesis biopsia de placenta dx. Pre-implantación + FIV fetoscopía

LAS METAS DEL DIAGNÓSTICO PRENATAL: Identificación de anomalías incompatibles con la vida o discapacitantes para preparar a los padres o para ofrecer la opción de aborto. Identificación de condiciones que pueden influenciar el momento, el lugar y el tipo de parto. Identificación de los fetos que se pueden ver beneficiados de intervención pediátrica temprana. Identificación de los fetos que se pueden beneficiar del tratamiento in utero.

Diagnóstico prenatal, alcances Enfermedades monogénicas, cientos de enfermedades diferentes. Malformaciones congénitas, muchas anomalías de la estructura fetal. Defectos cromosómicos fetales de todo tipo

Diagnóstico prenatal en Costa Rica Embarazo de alto riesgo asesoramiento ultrasonograma amniocentesis o cordocentesis la muestra se procesa en el laboratorio cariotipo fetal asesoramiento genético Amniocentesis en la Unidad de Medicina Materno-fetal del Hospital R.A. Calderón G.

Cultivo primario de “amniocitos” El botón celular se siembra en medios de cultivo ricos en nutrientes y factores del crecimiento celular. El cultivo es cerrado y/o abierto Colonias no confluentes con suficientes mitosis “arresto” mitótico y cosecha por suspensión o in situ. Análisis cromosómico bandeo GTG.

Análisis cromosómico Contar los cs de al menos 20 figuras mitóticas hacer el cariotipo completo de al menos 4 figuras mitóticas bandeadas resolución de bandeo estándar o sea  400 bandas células provenientes de al menos dos cultivos independientes

AMNIOCENTESIS PRE-REQUISITOS Asesoramiento: Riesgo genético, Riesgo del procedimiento, Confiabilidad y limitaciones, Demora para obtener el resultado, ….. El operador debe tener: Experiencia y pericia (al menos 30 amnios supervisadas para aprender y 30 anuales para manterner la pericia) Ultrasonografía de alta calidad de tiempo real Acceso a un laboratorio con experiencia en estudios dx prenatales. El obstetra debe estar preparado para abordar las posibles complicaciones de la amniocentesis

TÉCNICA DE AMNIOCENTESIS Se realiza a partir de las semanas (menstruales) 14-16 de gestación, cuando la tasa de células viables contra muertas es mayor, el útero es accesible por vía abdominal y hay suficiente cantidad de liquido amniótico (LA) (200-250ml) como para extraer 20 – 30 ml sin mayor riesgo. Debe realizarse bajo control ultrasongráfico directo, visualizando continuamente la punta de la aguja, la cual no debe ser más gruesa que número 22. Si para tener acceso al pozo de líquido amniótico es necesario atravesar la placenta con la aguja, se hace, pero se debe tener sumo cuidado para no tocar la inserción del cordón.

“amniocitos” Primera mitad del embarazo: membranas extraembriónicas, cordón y trofoblasto (capa superior, migran a través de poros en la membrana amniótica). Segunda mitad: derivadas propiamente del feto. Aumento directamente proporcional a la edad gestacional, viabilidad inversamente proporcional. Semana 14 viables el 20%, tercer trimestre < 5%

AMNIOCENTESIS TEMPRANA antes de las 14 semanas 5% fracaso para aspirar líquido 1 ml de líquido por cada semana gestacional predominan células de origen extraembrionario más % de fracasos en crecimiento celular riesgo mayor de pérdida fetal que para amnio convencional y biopsia de corion. la incidencia de talipes fetal aumenta 10 veces en relación con la convencional.

Cultivo celular y células no cultivadas El cultivo celular es complicado, caro, susceptible de problemas de crecimiento lento y de infección, y sobre todo, consume mucho tiempo. Se obtienen resultados más rápido usando células disponibles de inmediato pero la mayoría están muertas, pueden estar contaminadas con sangre materna y las mitosis espontáneas son muy escasas. Técnicas novedosas de citogenética molecular y de genética para obtener dx prenatales rápidamente: FISH AMNIO-PCR o QF-PCR.

Diagnóstico de trisomía mediante FISH

Limitaciones de FISH Técnicas Es muy laborioso Hay que ver muchas mitosis (25-50) Económicas Sondas son muy costosas

PCR Cuantitativa Fluorescente (QF-PCR) Descrita en 1993 para la detección prenatal de t21 y t13 Amplificación de marcadores polimórficos específicos para cada cromosoma Primers fluorescentes Análisis cuantitativo en un secuenciador

STRs (Short Tandem Repeats o microsatélites) Secuencias de 2-6 pb repetidas en tándem Polimórficos en longitud entre individuos TGTC Alelo materno Alelo paterno

STRs (Short Tandem Repeats o microsatélites) Distribuidos por todo el genoma Alto grado de variabilidad Productos fácilmente distinguibles Amplificación “múltiplex” permite un alto poder de discriminación en una sola prueba

Homocigota: Alelos del mismo tamaño Heterocigota: Alelos de diferente tamaño y pueden distinguirse uno del otro Homocigota: Alelos del mismo tamaño STR materno Electroforesis en gel de agarosa STR paterno QF-PCR Heterocigota 1:1 Homocigota

Detección de trisomía en muestras prenatales Tres alelos de diferente tamaño (trialélico) Proporción 1 : 1 : 1 Dos alelos de igual tamaño (dialélico) Proporción: 1 : 2

Intensidad de fluorescencia Tamaño en pares de bases (pb)

Ventajas de la técnica Muy exacta Resultados rápidos (24 h) Extracción de ADN de los amniocitos (sin necesidad de cultivo) Resultado confiable a pesar de que falle el cultivo

Ventajas de la técnica Varias muestras pueden ser manejadas por un solo operador Validada en Europa, Asia y EEUU Bases de STRs para todos los cromosomas

Alcances de la técnica DP de aneuploidías (totales y parciales) Detección de aneuploidías en células fetales en sangre materna Evaluación de productos de abortos espontáneos DP de otras enfermedades genéticas

Otros alcances Origen parental y meiótico de la no disyunción Detecta contaminación materna Interrupción del embarazo en casos de t21, t13 y t18 antes del cariotipo completo PGD (diagnóstico pre-implantatorio)

Limitaciones de la QF-PCR Se necesita equipo de costo elevado Múltiplex complejas STRs muestran diferentes frecuencias en poblaciones Mosaicismos con FP y FN

Biopsia de corion

Amniocentesis vrs muestra de vellosidades coriónicas ambas muy efectivas en dx cromosomopatía fetal amnio convencional menor tasa de fracaso y de falsos positivos, más segura (MVC con mayor riesgo de pérdida fetal y de deficiencias de miembros)  amnio convencional es preferible. Si es necesario que el dx se realice en el primer trimestre, es mejor la MVC por vía transabdominal, pues tiene tasas de fracaso menores que la transcervical, y menor riesgo de pérdida fetal que con la MVC transcervical y que la amnio del primer trimestre.

Embriogénesis normal durante las primeras cinco divisiones celulares (mórula de 32 células) La mayoría de las células están destinadas a formar el citotrofoblasto. De 8 células dentro de la masa celular interna, solo dos forman el embrión per se, el resto forman estructuras extra embriónicas (saco vitelino, amnion, corion, núcleo mesodérmico de las vellosidades coriales).

MUESTRA DE TEJIDOS FETALES INDICACIONES: cuando el dx no es posible ni con cariotipo ni con la tecnología del ADN cuando hay que corroborar un dx proveniente de amnio o de MVC cuando se necesita el dx rápido por llegar tarde al cuidado prenatal cuando el US ha detectado un marcador anatómico de aneuploidía Atresia duodenal y sd de Down.

cordocentesis

A partir de las 18 semanas de embarazo CORDOCENTESIS A partir de las 18 semanas de embarazo el promedio de pérdidas fetales, cuando interviene un operador adecuadamente preparado, a mediados del segundo trimestre, es de 1-2%. El cultivo de los linfocitos fetales demora 2-3 días, el análisis 1-2 días y el resultado final se obtiene en  4 días. Se usa sobre todo cuando el US detecta una malformación fetal sugestiva de trisomía

DIAGNÓSTICO PRENATAL MEDIANTE TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE MUESTRAS TRANSABDOMINALES 0,5 La biopsia de corion tiene más probabilidad de resultados ambiguos pues ~ 1-2% de las muestras reflejan mosaicismo confinado a la placenta. Además puede haber más chance de contaminación con células maternas.

Tamizaje prenatal de defectos genéticos Isabel Castro Volio INISA

Prevención primaria de trastornos genéticos Malformaciones congénitas: + ácido fólico control de la DMID control de mutágenos y teratógenos Aberraciones cromosómicas: desalentar la gestación en mujeres > 35 años Enfermedades monogénicas: identificación de portadores, en la población general o en poblaciones seleccionadas por raza, religión o bagaje étnico.

Prevención secundaria de trastornos genéticos Malformaciones congénitas: examen ecográfico de anomalías fetales determinación de la AFP sérica en la madre Aberraciones cromosómicas: edad de la madre (un filtro) marcadores bioquímicos en suero materno historia familiar y obstétrica marcadores sonográficos de cromosomopatía Enfermedades mendelianas: anamnesis familiar tamizaje de portadores de la enfermedad para la cual tienen riesgo.

Identificación de las parejas de alto riesgo: Tamizaje de enfermedades genéticas en la población en edad reproductora Identificación de las parejas de alto riesgo: tamizaje pre-concepción (historia familiar y médica, bagaje étnico, historia obstétrica) tamizaje de analitos en suero materno (para defectos tubo neural y cromosómicos) tamizaje mediante ecografía

Tamizaje (screening, cribado) prenatal Es la identificación, de entre individuos aparentemente sanos, de aquellos que tienen riesgo suficiente de un trastorno específico como para justificar una prueba o procedimiento diagnóstico subsecuente, o en algunas circunstancias, acción preventiva directa.

Requisitos para un programa de tamizaje prenatal ASPECTO REQUISITO 1. Trastorno bien definido 2. Prevalencia conocida 3. Historia natural bien conocida, importancia médica, tiene remedio 4. Financiero costo efectivo 5. Infraestructura disponible o fácil de instalar 6. Ética los procedimientos que siguen a un resultado positivo han sido acordados y son aceptables para todas las partes. 7. La prueba diagnóstica simple y rápida 8. El desempeño de la distribución de los valores de prueba la prueba en afectados y no afectados es conocida, el traslape es suficientemente pequeño y el punto de corte definido.

Tamizaje prenatal infraestructura

POBLACIÓN DE EMBARAZADAS Tamizaje prenatal POBLACIÓN DE EMBARAZADAS  TAMIZAJE   RIESGO BAJO RIESGO ALTO   NO ACTUAR PROCEDIMIENTO DIAGNÓSTICO

Cut-off level o punto de corte No afectados afectados # de em ba ra zos marcador EL MARCADOR PERFECTO Si existiera un marcador perfecto, entonces cualquier medición por encima del punto de corte indicaría la presencia del padecimiento que se está tratando de detectar. Por el contrario, una medición por debajo del punto de corte indicaría que el trastorno está ausente.

afectados Falsos psitivos Falsos negativos marcador # de em ba ra zos Punto de corte afectados No afectados Falsos psitivos Falsos negativos marcador UN MARCADOR TÍPICO En la práctica, todos los marcadores con que contamos actualmente son imperfectos. El punto de corte se establece arbitrariamente. Un resultado falso negativo es uno que se ubica por debajo del punto de corte, aunque el padecimiento está presente. Un resultado falso positivo es el que arroja un resultado por encima del punto de corte a pesar de que el trastorno no está presente. El éxito del tamizaje se expresa como la tasa de detección para una cierta tasa de falsos positivos. El éxito de cualquier marcador individual puede aumentarse muchísimo mediante la medición de una combinación de marcadores diferentes. Se considera que un programa de tamizaje efectivo basado en varios marcadores es el que ofrece una tasa de detección mayor que 85% para una tasa de falsos positivos de 5%.

Marcadores séricos más comunes Del segundo trimestre (15-20 semanas): AFP alfa feto proteína uE3 estriol no conjugado Inhibina A GCh gonadotrofina coriónica humana De 10 a 20 semanas: GCh libre De 8 a 13 semanas: PAPP-A proteína plasmática asociada al embarazo - A.

Marcadores sonográficos más comunes Entre las 11–13 semanas gestacionales Translucencia nucal (nuchal translucency) Entre las 20-24 semanas Pliegue nucal (nuchal fold)

TAMIZAJE PRENATAL TERMINOLOGÍA Múltiplo de la Mediana (MoM):es el valor observado de la paciente dividido por el valor de la mediana de los embarazos normales durante la misma edad gestacional. Se utiliza para normalizar los resultados, ya que la concentración del marcador varía con la edad gestacional. La concentración del marcador sérico de la embarazada dividido por el valor de la concentración media de embarazos no afectados de la misma edad gestacional.

TAMIZAJE PRENATAL TERMINOLOGÍA Tasa de detección: la proporción de población afectada con resultados tamizaje positivo. Tasa de falsos positivos: la proporción de población no afectada con resultados tamizaje positivo.

Tamizaje de defectos del tubo neural Se inició en los años 80 Niveles  de AFP (alfa feto proteína) Tasas de detección ~ 75-90% de defectos abiertos del TN > 90% de anencefalias Además puede detectar ~ 85% de los defectos de la pared ventral 16 - 18 semanas gestacionales Ámbito 15 a 22 semanas.

Usos de la alfa feto proteína Los puntos de corte para defectos abiertos del tubo neural, como los diversos tipos de espina bífida, son de 2 a 2,5 MOM en embarazos de un solo feto, de 4 a 5 MOM en embarazos gemelares. Después de un resultado tamizaje positivo sigue una ecografía detallada y en algunos casos una amniocentesis para cuantificar AFP y acetilcolinesterasa.

Marcadores séricos en embarazos con Down (2do trimestre) AFP uE3 GCh total subunidad  libre subunidad  libre Inhibina A MoM promedio  0.7  0.6  1.8  2.3  1.3 

LA CONCENTRACIÓN DE SUBUNIDAD BETA DE GONADOTROFINA CORIÓNICA EN EMBARAZOS CON Y SIN S. DE DOWN

Tamizaje prenatal, distribuciones de riesgo usando los marcadores alfa feto proteína, estriol no conjugado y gonadotrofina coriónica

DETECCIÓN DE SÍNDROME DE DOWN Si se selecciona a las candidatas para diagnóstico prenatal en base a la edad solamente, la tasa de detección es de  30 %. Si se ofrece el tamizaje a todas las embarazadas, entre 15 y 22 semanas gestacionales, utilizando los marcadores bioquímicos presentes en la sangre de la madre, la tasa de detección (con un 5% de falsos positivos), dependerá del número de marcadores a utilizar: AFP  35 % AFP + GCh  60 % AFP + GCh + uE3 (test triple)  70 % AFP + GCh + uE3 + inhibina A  80%

Quad o tamizaje cuádruple Segundo trimestre Punto de corte 1 : 270 AFP + GCh + Ue3 + INH-A Tasas de detección de T21 = Menores de 35 años ~ 75% 35 años o mayores ~ > 80%

Factores que afectan la interpretación de los resultados del tamizaje prenatal La edad materna la edad gestacional el peso materno el grupo étnico el embarazo gemelar la diabetes insulino-dependiente el sangrado vaginal la historia obstétrica previa

Estrategias de tamizaje prenatal del segundo al primer trimestre Diagnóstico más temprano y posible intervención. Beneficios sicológicos, el diagnóstico se conoce antes. La inclusión de la medición de la translucencia nucal proporciona información adicional al programa de tamizaje.

Translucencia nucal La tasa de detección en combinación con la edad materna, con 5% falsos positivos es de  63 - 73% La medida de la translucencia nucal es una ecografía temprana que se usa para medir el grosor del espacio lleno de fluido en la nuca fetal. Un incremento del líquido puede indicar la presencia de T21, u otra anomalía cromosómica, estructural o genética.

La translucencia nucal (NT) y el hueso nasal (NB) son marcadores ecográficos de trisomía 21 Feto de 12 semanas con ambos marcadores normales Feto de 12 semanas con trisomía 21 y con aumento de la translucencia nucal y con ausencia del hueso nasal

Marcadores ecográficos de trisomía La ecografía de la izquierda muestra un feto con aumento anormal de la translucencia a nivel de la nuca. El feto de la derecha muestra un tamaño normal de la zona de translucencia nucal

Otro marcador ecográfico de trisomía es el hueso nasal El ultrasonido del feto de la izquierda, que tiene T21, muestra la ausencia del hueso de la nariz en la vista de perfil y esto es anormal. El de la derecha muestra la presencia normal del hueso nasal

Feto con Down Feto normal

Detección de s. de Down en embarazadas de 10 a 14 semanas de gestación Cuando se utilizan marcadores bioquímicos en la sangre materna + los hallazgos ultrasonográficos de presencia del marcador translucencia nucal, la tasa de detección con 5% de falsos positivos es de  90%. Estos marcadores bioquímicos son: PAPP-A + GCh subunidad  libre Combined test es el tamizaje del primer trimestre que combina la medida de la translucencia nucal + la subunidad  de la GCh + la proteína plasmática A asociada al embarazo + la edad de la madre.

Las mujeres que han elegido el tamizaje del primer trimestre o la biopsia de corion, deben tener acceso al tamizaje de defectos del tubo neural cuantificando AFP en el suero en las semanas 16-18 de gestación.

Tamizaje prenatal, marcadores del primer trimestre

La experiencia acumulada en tamizaje prenatal El 80% de las embarazadas son tamizadas. Con un 5 a 6% de mujeres tamizaje positivo. Cerca de 80% de las mujeres tamizaje positivo se someten a una prueba diagnóstica invasiva. De aquellas con cariotipo positivo por síndrome de Down, cerca del 90% escogen interrumpir el embarazo (Wald et al 1997).

Diagnóstico fetal ultrasonográfico

Marcadores sonográficos para tamizaje prenatal De trisomía 13 o 18: - agenesia del cuerpo calloso, hernia diafragmática, labio o paladar hendido, exomfalos, uropatía obstructiva, doble salida del ventrículo derecho. De trisomía 21: - grosor del pliegue nucal > 6mm, exomfalos, atresia duodenal, intestino hiperecogénico, CIV, higroma quístico, ausencia o hipoplasia del hueso nasal. De trisomía 18: - reducción de miembros, quistes plexo coroides + ….. De monosomía X: - higroma quístico. De espina bífida: - signo del limón, signo del banano.

IMAGEN ULTRASONOGRÁFICA DE UN FÉMUR DE LARGO NORMAL

Imagen ultrasonográfica de cerebelo fetal normal

Signo del limón asociado con defectos de cierre del tubo neural fetal.

Espina bífida fetal

Dilatación de la pelvis renal fetal

US de riñón fetal poliquístico

Hidrops fetalis

Hidrocefalia fetal

Gastrosquisis fetal

Pequeño exomfalos fetal

Imagen de resonancia magnética de un feto con hidrocefalia severa.

Investigaciones en curso sobre la obtención de muestras fetales a partir de la sangre materna, pasos necesarios: anticuerpos monoconales sensibles y específicos para células fetales (eritroblastos, linfocitos y del sincitiotrofoblasto) clasificación celular activada por fluorescencia para enriquecimiento análisis genético con técnicas muy sensibles como PCR o FISH diagnóstico genético preimplantatorio, requiere de tecnología FIV de punta, biopsia embrionaria al tercer día de la fecundación (6-10 células) y PCR o FISH. La biopsia del blastocisto es otra posibilidad.

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