FLUJO CELULAR En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, utilizados en : Medición de las células CD4 Monitorización de la enfermedad por VIH 1.El primero conocido como un FLUJO CELULAR DE CORRIENTE EN AIRE O DE FLUJO EN AIRE: permite que el punto de medida óptico se encuentre directamente sobre la corriente de muestra ; este tipo de flujo minimiza a distancia entre la cámara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra necesario entre las mismas. Las ventajas de las puntas de las puntas en la corriente en aire, son importantes para la clasificación celular; las desventajas de estos sistemas son : fineza del cuarzo y por tanto la difracción del haz del láser o la dispersión de la señal; y la sección cuadrada tan amplia (200²µm) impide un correcto control del flujo de éxito de las células de flujo de cuarzo en el sistema clínico depende de la iluminación y de las ópticas de recogida. En el análisis del ADN, las células son analizadas con un flujo bajo para aumentar el tiempo que permanece la partícula en el haz, lo que permite una mayor sensibilidad y un mejor CV. Muchos de estos sistemas clínicos están comprometidos en acomodar dos aplicaciones frecuentes: inmutipificación y análisis del ADN.

COLORES Y MÁS COLORES: APLICACIONES DE LOS FLUOROCROMOS Los fluorocromos más frecuentes son : el isotiocianaton de fluoresceína (FITC;530 nm de emisión) y el ficoeritirin (PE;575 nm de emisión ) en la medida del ADN. El FIRC y el PC se conjugan directamente por el anticuerpo de interés y simultáneamente se añaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo secundario como una IgG de carnero antirratón (GAM) marcada con fluoresceína para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluorescencia de fondo. Existen tinciones en el laboratorio clínico que permiten mediciones simultaneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales marcados directamente y excitados en un laser a 488 nm. Las tinciones con una emisión roja o roja lejana incluyen el tándem PE Texas Red (625 nm de emisión), el tándem PE-Cy -5 (675 nm de emisión ) y la aloficocianina (675nm de emisión), por nombrar unos pocos. Los primeros tándem eran problemáticos ya que el exceso de PE libre en la solución conducía a un exceso de fluorescencia de fondo.

Este método se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando fluoresceína como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el núcleo o el citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. El empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT –PCR) es más habitual. La detección de señales de RT- PCR en paciente con remisión clínica todavía no esta clara, mientras que la detección del MRD por amplificación de la PCR de los genes antigénico se ha correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento. Por ejemplo: Con la disponibilidad delas tinciones rojas y rojas lejanas, se puede desarrollar un análisis de la población de VIH en un único tubo con gran seguridad. Un tubo de 100 µl de sangre completa se tiñe simultáneamente con CD45, PE – Cy – 5, CD3 PE – Texas Red, CD8 FITC y CD4 PE. Con el nuevo procesamiento de señalización digitalizado, la comprensión (vide infra) se lleva a cabo fácilmente; y se realiza al análisis empleando el CD45 como un agente iniciador mediante dispersión lateral (SSC) y el análisis simultáneo de CD3, CD4 y el CD8. Estas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia como un iniciador en lugar de los parámetros habituales de dispersión de luz. Esto es posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes de la mayoría de las células o no tienen competición autofluorescente a estado natural como se encuentra con el FITC.

El empleo de la fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del análisis multiparamétrico llegue a ser una realidad, los parámetros pueden evaluar: 1.Diferentes poblaciones funcionales de una población celular particular empleando unas sondas fluorescentes intracelulares. 2.El empleo de muchos colores para identificar pequeños grupos de otros sucesos no identificables de otra forma ( como el MRD). 3.El estatus de activación celular en una etapa particular de la enfermedad ( Ej. Empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estratificación del VIH empleando un abordaje en ancla. 4.Observar la expresión de la superficie celular y el DI o fase S CD19 en la leucemia aguda

La citometría de flujo emplea parámetros similares a aquellos que se han empleado durante muchos años en a hematología incluyendo el tamaño ( por dispersión de luz hacia adelante), la granulación citoplasmática ( dispersión lateral, las afinidades por marcadores específicos y otros, y las combinas con las herramientas inmunológicas; estas incluyen múltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien PI o 4´6- diamidin-2-fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la detección simultanea de estos parámetros por sistemas analíticos actuales. La definición de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran fondo hizo necesario el uso de una logaritmo que resta canal por canal para diferenciar lo positivo de lo negativo. En los casos en los que la población celular tiene un limite definido entre negativo y positivo se coloca un cursor de modo que no mas de un 2% de los acontecimientos considerados como negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos positivos empleando un control isotípico emparejado. INMUNOFENOTIPIFICACIÓN: APLICACIÓN A LAS MUESTRAS HABITUALES Y LEUCÉMICAS

La aplicación de reglas estrictas y rápidas a los cursores de posición conducía a una infraestimación de los grupos positivos. El fallo de esta forma de actuación se hace especialmente dramático en el análisis de la monoclonalidad de la expresión de cadenas ligeras κ y λ, que a menudo se perdían diferencias pequeñas, pero significativas. Los nuevos algoritmos de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de definición de grupos basándose en los significados de las intensidades de las poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas así como la cuantificación del MESF real ( vide infra ). Con la llegada de la fluorescencia multicolor surgió la necesidad de analizar el numero de celulas que expresaban uno o más colores al mismo tiempo en una población celular particular identificada por las regiones FALS y SSC. La técnica fue modificada con posterioridad para permitir mas recepciones, y otros fabricantes con el software realizaron esta aproximación binaria con base postanalítica, identificando las poblaciones de la médula ósea empleando el CD45 frente al SSC, una investigación única para identificar las poblaciones heterogéneas presentes en la médula ósea. El empleo del CD45 como parámetro de entrada ha simplificado el análisis de la medula ósea, las leucemias y los paneles de VIH, en estas revisiones el CD45 se establece como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersión luminosa anterior o a la dispersión lateral; esto permite la identificación de una población potencial de blastos (malignos).

Los principales tipos de tumores ( en muestras en fresco, congeladas y parafina) y de valor clínico de la medida de la ploidía por DI y el valor de la fase S, fueron analizados en términos de efectividad como marcadores pronósticos. En cada caso, el ID y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronósticos de lo que se esperaba, esto fue atribuido a la variabilidad en la realización de la técnica y el análisis de estos ensayos ( tanto en la preparación de instrumentos como de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor ANALISIS DEL ADN

PREPARACION DE LA MUESTRA Los métodos de preparación del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar, los mas utilizados son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley. En cada caso, ya estén las celulas enucleadas o conservada la membrana celular, el marcador PI de ADN es el que mas frecuente se utiliza en la mayoría de los laboratorios. La tinción PI es directa a condición de que se sigan el tiempo, la saturación y los parámetros de extracción del ARN. Las medidas de las alteraciones macroscópicas del cariotipo se realizan comparando el pico ( intensidad fluorescente, captación de PI) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta medición incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor, el índice G ₂ /G ₁ o la linealidad del instrumento, la linealidad medida por el paquete de software de deconvolución y e porcentaje del tumor presente.

Las mediciones resultantes de la fase S y del ID utilizando un modo de análisis paramétrico simple (PI) están sujetas a los algoritmos de deconvolución, llevando una gran variabilidad entre los laboratorios. Deben aplicarse ciertas recomendaciones especificas a ciertos tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen análisis en concordancia, evitando la ambigüedad en la interpretación y el rendimiento en el laboratorio clínico, ya que esto contribuye a la discordancia de los resultados en estudios comparativos así como en las pruebas de competencia. Esto es especialmente cierto en la clasificación de los valores de la fase S. Debido a la dificultad en el análisis del histogramas del ADN, se ha propuesto que las mediciones del ADN las realicen laboratorios expertos Deben existir estrictos controles de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronósticos y como medidas de la actuación y practica médica. Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los derivados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU), diversos abreviados y otros, para mejorar la calidad de los modelos en la estimación de las propiedades proliferativas y cinéticas de un determinado tumor. Las medidas de proliferación no son iguales que las medidas de la cuantificación de la fase S, que son un modelo estático o un dibujo en el tiempo de todas las celulas analizadas.

El histogramas de un parámetro proyecta resultados razonables cuando se trata de una población asincrónica, relativamente homogénea. El marcaje por pulsos se utiliza para medir la efectividad de la irradiación y la quimioterapia obteniendo medidas reales de las celulas G ₀ / G ₁, así como de los compartimentos G ₂ + M, lo que no es posible empleando medidas paramétricas simples de la fase S. Pueden utilizarse otras técnicas con sondas nucleares y citoplasmáticas, así como marcadores de superficie para separar la población de interés de la mezcla de tipos celulares, este tipo de análisis multiparamétrico es muy útil para medir la fase S en las neoplasias hematológicas malignas Estos métodos normalmente incluyen la tinción del marcador de superficie de interés ( ej: KI – 67, ciclina B1, citoqueratina, CD10) con el anticuerpo monoclonal, fijación en alcohol ( o fijación comercia y permeabilización reactante) y y tratamiento con un detergente para permitir la entrada de PI u otro marcador nuclear. Los métodos de tinción se modifican selectivamente para conservar las propiedades de la membrana y núcleo especificas de la sonda de interés.