Departamento de Parasitologia Curso de Toxocariasis Departamento de Parasitologia Instituto Nacional de Enfermedades infecciosas ANLIS “ Carlos G. Malbran”

Introducción La Toxocariasis es una zoonosis causada por la ingestión de huevos embrionados Toxocara canis y Toxocara cati

Ubicación Taxonómica Reino : Animalia philum : Nematoda subclase: Secernentea orden: Ascaridia genero : Toxocara especie : canis catti

El ciclo de vida es complejo El parásito adulto vive en el intestino de los perros y gatos Los huevos en el medio ambiente Las larvas tienen un proceso de migración y enquistamiento hístico

Durante la gestación se activan las larvas Se produce una migración transplacentaria Los cachorros nazcan infectados

Infeccion alta :neumonías trastornos intestinales vómitos, diarreas , disminución del crecimiento la muerte del animal Los cachorros nacen infectados al mes de nacer comienzan a expulsar huevos

. Se eliminan alrededor de 200.000 huevos por día A temperatura de 25ºC a 35ºC y humedad 85% desarrollan en 10 días a larvas infectivas puden ser dispersados por la lluvia y otros factores ambientales

Hembra mide 10 cm de longitud Macho mide 6 cm de longitud Parásito adulto habita el intestino de los cánidos Hembra mide 10 cm de longitud Macho mide 6 cm de longitud

Los huevos son eliminados al exterior y en condiciones de temperatura y humedad maduran a huevos infectivos

permaneciendo infectivos Los Huevos son dispersados por los vientos y otros factores ambientales permaneciendo infectivos

huevo larvado INFECCION EN EL PERRO HUESPEDES PARATENICOS HUEVO ELIMINADO huevo larvado INFECCION EN EL PERRO

Larva Infectiva

Infección en el hombre El hombre ingiere los huevos, las larvas se liberan en el intestino , dando origen a dos síndromes : Larva Migrans Visceral y Larva Migrans Ocular Toxocariasis forma clínica indiferenciada Toxocariasis encubierta

LMV : dolor abdominal, hepatomegalia, esplenomegalia, linfoadenopatías, disminución del crecimiento, anemias, fiebre y disminución del apetito. Tos y broncoespasmos producidos por la migración de las larvas en los pulmones. Las larvas se pueden acumular en el sistema nervioso central donde producen convulsiones, parálisis y otros desórdenes neurológicos. Datos de laboratorio : aumento de eosinófilos, leucocitos e hipergamaglobulinemia

LMO: es una infección unilateral, que presenta disminución de la visión, estrabismo, leucocoria, endoftalmitis, granulomatosis, retinocoroiditis, papilitis óptica, uveítis y otras lesiones . Datos de laboratorio :no presentan aumento de eosinófilos, leucocitos y tampoco se observa aumento de gammaglobulinas. Toxocariasis indiferenciada : pacientes con síntomas no específicos como fiebre, dolor abdominal, dolor de cabeza, anorexia adenitis cervical y tos, que se acompaña con niveles elevados de anticuerpos anti T.canis en circulación

Toxocariasis encubierta: fiebre, anorexia, dolor de cabeza, dolor abdominal, vómitos, sueño, desórdenes en el comportamiento, faringitis, neumonía, tos, linfoadenopatías, hepatomegalia, anticuerpos elevados anti Toxocara, con niveles normales de eosinófilos

DIAGNOSTICO EN HUMANOS El diagnóstico médico clínico en el hombre es incierto, los signos y síntomas que presenta son comunes con otras enfermedades infecciosas. En el hombre no alcanza el estadío adulto en el intestino, por lo tanto no es posible realizar el diagnóstico parasitológico directo

IgE específica útil para evaluar el tratamiento ELISA con el antígeno excretor – secretor, el cual se obtiene por cultivo de larvas de segundo estadío en un medio de cultivo libre de proteínas En el Western blot se observan siete bandas polipeptídicas que se dividen en bandas de elevado peso molecular y de bajo peso molecular. 200, 147, 132, 70, 50, 35, 30, 28 ,24 kDa IgE específica útil para evaluar el tratamiento Isotipos de IgG, el tipo predominante es IgG1.

Dot ELISA se observaron reacciones cruzadas, además esta técnica no fue evaluada en estudios de campo Test de avidez valor diagnóstico para la correcta utilización del tratamiento de esta parasitosis Proteína Catiónica Eosinofílica tendría relación con una posible atopía, presentan anticuerpos anti Toxocara de tipo IgG4 PCR, RFLP, RAPD y SSCP para diferenciar las distintas especies de Toxocara canis

ELISA

Sembrar el antigeno

Correr Transferir

Bloquear lavar cortar Incubar sueros

lavar Anti humano HRPO

DAB

98 66- 45- 35- 21 14 PM - + + + + +

ANTÍGENO EXCRETOR SECRETOR Sustancia semejante a la mucina, constituida por glicoproteínas y proteasas,que se originan en las glándulas secretorias y esofágicas y en la cutícula del parásito Es un mosaico antigénico contra el que se dirigen los anticuerpos,compuesto por cinco moléculas antigénicas mayores de peso molecular 32,55,70,120,400 kDa

Reaccion Cruzada Enfermedades no parasitarias Enfermedades parasitarias Strogiloidiasis Artritis Hidatidosis Sifilis Triquinosis Eosinofilia Ascaridiasis

Western Blot con antígeno ES/L2 total con suero de enfermedades parasitarias y no parasitarias

Purificación del antígeno ES/L2 de T.canis Cromatograma correspondiente a la purificación del antígeno Es/L2 de T.canis obtenido de un equipo FPLC Pharmacia.

pM 14 15 16 18 19 21 24 26 27 A B 98 - 66.2 - 45 - 35 - 21.5 - 14.4 - 98 - 66.2 - 45 - 35 - 21.5 - 14.4 - SDS-PAGE y coloración de plata de los tubos 14,15,16,18,19,21,24,26,27,A:28-29,B:30-31-32, obtenidos del Cromatograma.

PM Tx 24 26 18 A B 98 - 66.2 - 45 - 35 - 21.5 - 14.4 - Wester –blot de los tubos seleccionados, revelado con suero hiperinmune. Línea 1 Antígeno ES/L2 total de T.canis, línea 2 tubo 24, línea 3 tubo 26, línea 4 tubo 18, línea 5 tubo 27, línea 5 tubos 28-29(A), línea 6 tubos 30-31-32(B)

Western blot con sueros de cerdo Fila 1 grupo control. Fila 2 y 3 grupo infectado PM 1 2 3 98 - 66.2 45 - 35 - 21.5 - 14.4 - 

Western blot con suero de Humanos PM 1 2 3 4 5 98 - 66.2 - 45 - 35 - 21.5 - 14.4 - Línea 3 suero sin sospecha clínica de Toxocariosis Línea 4 y 5 suero de paciente con sospecha clínica de Toxocariosis. Línea 1 suero control negativo Línea 2 suero control positivo

Sensibilidad y Especificidad del ELISA con antígeno ES/L2 total y purificado de T. canis

Discusión Sueros de pacientes con sospecha clínica de Toxocariosis: ES/L2 total : bandas de 120, 70, 55, 32, 30 kDa El triplete de aproximadamente 120 kDa es responsable de la reactividad cruzada con las distintas patologías ES/L2 purificado: 70-55 kDa Las Bandas de 70 y 55 kDa se observaron en los sueros de los cerdos En la técnica de ELISA el antígeno purificado sólo es reactivo a títulos bajos

La especificidad es del 99% con el antígeno purificado El antígeno ES/L2 diferencia pacientes sin sintomatología clínica de Toxocariosis Pacientes con sintomatología clínica de Toxocariosis tienen títulos mayores o iguales a 1/32 No se puede saber si se trata de una Toxocariosis reciente o es una enfermedad antigua

Inmunofluorescencia indirecta 1 hora a 37º C Control 4 hora a 37º C

Inmunofluorescencia indirecta 1 hora a 38º C Control      4 hora a 38º C

Inmunofluorescencia indirecta 1 horas a 39º C Control 4 horas a 39º C

Infeccion experimental Grupo N°1 : Control (sin infección) Grupo N°2 : 400 huevos larvados de T.canis Grupo N°3 : 400 huevos no larvados de T.canis Grupo N°4 : 2000 huevos larvados de T.canis Grupo N°5 : 2000 huevos no larvados de T.canis Grupo N°6 : 400 huevos de Áscaris lumbricoides

Los ratones fueron sangrados en el día cero de infección y a los 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 70, 98, 113, 127 y 360 días post infección. Los sueros fueron analizados por la técnica de ELISA empleando antígeno excretor-secretor obtenido de larvas de segundo estadío mantenidas en medio de cultivo.

El grupo de ratones infectados con huevos larvados de Toxocara canis presentó títulos elevados de anticuerpos de tipo IgG . .

EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA HUMORAL EN CONEJOS INFECTADOS EXPERIMENTALMENTE CON HUEVOS DE T.CANIS

Materiales y métodos conejos hembras de 1800 a 2000 g desparasitados antes de comenzar la experiencia e infectados por vía oral, grupo 1: 10 huevos larvados de T.canis / ml, grupo 2: 100 huevos larvados / ml, grupo 3: 1000 huevos larvados / ml grupo 4: control

Los conejos fueron sangrados en el día cero de infección cada 7 días durante el primer mes cada 15 días durante cuatro meses mensualmente hasta el año Al año se reinfectaron con la misma dosis los distintos grupos

Resultados

El Western blot permite confirmar el diagnostico Conclusión El diagnóstico es problemático El antígeno purificado ayuda en el diagnostico de la Toxocariosis El Western blot permite confirmar el diagnostico Todavía no se puede diferenciar entre etapa aguda y crónica de esta parasitosis.

Epidemiología de Toxocara canis en la población canina de dos áreas de distinto nivel socioeconómico, Gran Buenos Aires, Argentina. Objetivo evaluar y comparar en dos áreas piloto del Gran Buenos Aires de distintas características socioeconómicas la prevalencia de Toxocara en los perros

Materiales y Métodos Área de estudio Dos Radios Censales de aproximadamente 1000 habitantes definidos por el Instituto Nacional de Estadísticas y Censos (INDEC) en el Partido de San Martín, Gran Buenos Aires, Argentina. (34°34' Lat. Sur; 58° 31' Long. Oeste).

Examen parasitológico método de Teleman Examen serológico El antígeno excretor secretor (ES/L2) ELISA Análisis de datos el test de independencia de 2 el test de 2 para tendencia lineal de proporciones.

La prevalencia por examen coprológico fue 9% (5/53) en AR y 19% (10/52) en AP (2 no significativo).) Las prevalencias serológicas fueron 22% (2/9) en AR y 40% (15/37) en AP (2 no significativo

AR los machos mostraron mayores prevalencias que las hembras (22% vs AR los machos mostraron mayores prevalencias que las hembras (22% vs. 3%, 2= 5,22, pFisher<0,05) AP los cachorros menores de 1 año de edad (60% vs. 3%, 2= 22,56, pFisher<0,01) resultaron los más prevalentes. la prevalencia resultó mayor en los animales que no salen para ambas áreas

Los cachorros aportaría un mayor número de huevos al medio las reinfecciones frecuentes en los animales adultos del área precaria, que no fueron detectadas en el área residencial.

En el área residencial la principal vía de infección es la transmisión vertical: la desparasitación de los cachorros puede ser efectiva En el área precaria no resultaría suficiente y debe incluirse el control parasitario de la población canina adulta. Este control tratar con antihelmínticos, control demográfico d control ambiental disminuyendo

Curva TG –ROC   Comparación de la técnica de ELISA con antígeno ES vs. el Antígeno de la proteína recombinante de 70 kDa

Elisa con proteína recombinante de 70 kDa realizado con suero de perros infectados naturalmente con T. canis y suero de ratas infectadas experimentalmente con T.canis.  

Elisa con proteína recombinante de 70 kDa realizado con suero de pacientes con sospecha clínica de Toxocariasis y suero de individuos con parasitológico negativo y eosinofilia normal.  

Normales sospechosos de Toxocara otras patologías Categoría de pacientes Comparación de Elisa con proteína recombinante con distinta categoría de pacientes.

  ELISA ES total ELISA Recombinante 70 kDa IC (95%) Sensibilidad (%) 100.0 99.55-100.00 Especificidad(%) 69.35 68.48-70.23 87.10 86.24-87.95 Valor predictivo +(%) 85.50 85.08-89.91 93.33 92.89-93.78 Valor predictivo -(%) 98.84-100.00 99.06-100.00   Performance del test de ELISA con Antígeno ES- total vs. ELISA con proteína 70 en pacientes con LMV.

  ELISA ES total ELISA Recombinante 70 kDa IC (95%) Sensibilidad (%) 83.3 80.45-86.22 100.   96.67-100.00 Especificidad (%) 69. 68.48-70.23 87.1 86.24-87.95 Valor predictivo +(%) 44.1 42.55-45.69 65.2 62.93-67.51 Valor predictivo -(%) 93.4 92.35-94.61 99.06- 100.00   Performance del test de ELISA con Antígeno ES total ELISA vs. ELISA con proteína recombinante de 70 kDa en pacientes con LMO.

MUCHAS GRACIAS !!!!!!!!!!!