Mutagenesis por inserción, únicamente factible en organismos con elementos de inserción funcionales y sistemas de transformación altamente eficaces. La producción de colecciones es costosa. Recolección de alelos de éxito variable Downregulation mediada por RNA, “únicamente” requiere que el sistema sea transformable (transitoria- o establemente) Genética reversa II. Construcciones antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.

Genética reversa II En los 80s ya se había observado en E.coli que RNAs de 100 b complementarios a mRNAs daban lugar a una disminución apreciable en la síntesis de las correspondientes proteínas A principios de los 90s ya se conocía en detalle el proceso de regulación de la traducción mediado por RNA-AS en determinados genes de C. elegans (genes reguladores lin-4 y let-7) A lo largo de los 90s se utilizó una estrategia consistente en la eliminación de la actividad génica mediante la expresión, vía transgénesis, de un RNA antisentido

Genética reversa II Ventajas: Flexibilidad, inactivación de miembros específicos o de toda una familia de genes (redundancia) Distintos alelos en distintos eventos de transformación Dominante?

Genética reversa II Métodos de análisis: Presencia de la construcción Nivel de transcripción Acumulación de proteína!!!!!!!!!!! Problemas: Resultado impredecible Análisis Genético difícil si se da inestabilidad Las perspectivas de utilización de esta tecnología han mejorado cuando se han comprendido las bases moleculares de los distintos mecanismos de silenciamiento post-transcripcional

Genética reversa II. Construcciones antisentido+miRNA+siRNA/RNAi. Plant gene silencing regularized G. Bruening (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13349–13351 Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA (1998) P. M. WATERHOUSE, M. W. GRAHAM, AND M-B. WANG. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,13959–13964 Virus resistance and gene silencing: killing the messenger (1999) P. M. Waterhouse, N. A. Smith and M-B. Wang. Trends in Plant Sciences 4,

Lee, RC and Ambros, V (2001). An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294, Lau, NC, Lim, LP, Weinstein, EG, and Bartel, DP (2001). An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294, Lagos-Quintana, M, Rauhut, R, Lendeckel, W and Tuschl, T (2001). Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294, MicroRNAs in plants. (2002). Brenda J. Reinhart, Earl G. Weinstein, Matthew W. Rhoades, Bonnie Bartel and David P. Bartel1. Genes Dev. 16: Genética reversa II. Construcciones antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. (1998). Fire, A, Xu, S, Montgomery, MK, Kostas, SA, Driver, SE, and Mello, CC Nature 391, RNA as target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans. (1998). Montgomery, MK, Xu S, and Fire A. Proc. Natl Acad. Sci. 95, RNA interference: It’s a small RNA world (2001) E. G. Moss. Current Biology 11 Genome-wide RNAi (2001) R. Barstead Current Opinion in Chemical Biology 5, 63–66 Genética reversa II. Construcciones antisentido+miRNA+siRNA/RNAi.

Genética reversa II En C. Elegans, la inyección de un RNA duplex provoca pérdida de función del gen correspondiente.

Genética reversa II El efecto está mediado por la degradación del correspondiente mRNA.

Genética reversa II Conclusiones de los trabajos con RNAi en C. elegans: 1.Silenciamiento inducido por dúplex, apenas por S o AS 2.Específico del RNA homólogo del dsRNA 3.El dsRNA debe corresponder a secuencia de exón, probaron intrones y promotores (mecanismo citoplásmico, PTGS) 4.El mRNA diana desaparece 5.Unas pocas moléculas de dsRNA/célula son suficientes. El dsRNA debe amplificarse o actuar catalíticamente 6.El efecto del dsRNA se extendía a otros tejidos e incluso a la progenie 7.Sugirieron que esto podría explicar el efecto PTGS observado en plantas 8.Especularon que dsRNA podría explotar un mecanismo fisiológico de “gene silencing”

Un modelo para el silenciamiento Silencing genes silencing genes (2000) S. N. Covey. Trends in Plant Science 5, RNA silencing in plants (2004) David Baulcombe. Nature, 431, Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi. Cell, Vol. 117, 1–4, April 2, RNAi: RISC Gets Loaded. Cell, Vol. 123, 543–553, November 18, 2005 Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642–655, 2009 El mecanismo de RNAi se ha detectado en todos los eucariotas testados (excepto S. cerevisiae). En células de mamífero no se pueden usar dsRNA>21 b (sin desencadenar apoptosis). El problema está siendo diseccionado genéticamente en organismos modelo como C. Elegans, Drosophila, Arabidopsis o Neurospora

Inducción de los RNA induced Silencing complexes (RISC) por siRNA Excepto insectos y mamíferos

Inducción de los RNA induced Silencing complexes (RISC) por siRNA

Genética reversa II Aplicaciones del modelo Consruir vectores para generar organismos transgénicos RNAi es fácil Actualmente existen aplicaciones en red (fundamentalmente en páginas de casas comerciales) que facilitan el diseño de construcciones para producir in vivo o in vitro tanto siRNAs como miRNA También es posible adquirir librerías de RNAi pre-testados para experimentos “genome wide” Discutir validez de experimentos de silenciamiento “transitorio”

RNA Interference-Based Gene Silencing as an Efficient Tool for Functional Genomics in Hexaploid Bread Wheat Silvia Travella, Theres E. Klimm, and Beat Keller Plant Physiol. Volume 142(1):6-20 September 6, 2006 Copyright © American Society of Plant Biologists. All rights reserved. Genética reversa II. Un ejemplo

Location of the wheat ESTs used to construct the RNAi vectors in their corresponding wheat consensus sequence and in the corresponding full-length cDNAs identified in rice Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20 Copyright © American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

RNAi-mediated specific silencing of the wEIN2 genes in hexaploid wheat Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20 Copyright © American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

T2 generation analysis of the homozygous T1 EIN2-RNAi transgenic plant 1 generated from the T0 line 10 Travella S. et.al. Plant Physiol. 2006:142:6-20 Copyright © American Society of Plant Biologists. All rights reserved.

Genética reversa II. Otro ejemplo A Global In Vivo Drosophila RNAi Screen Identifies NOT3 as a Conserved Regulator of Heart Function Cell 141, 142–153, April 2, 2010 El objetivo de este trabajo es identificar, y caracterizar funcionalmente, genes implicados en la función cardiaca, en humanos La herramienta experimental utilizada inicialmente es el RNAi condicional en Drosophila. Líneas GAL4/UAS-RNAi del “Vienna Drosophila RNAi Center” (VDRC)

Genética reversa II. Otro ejemplo Gen de interés El material transgénico del VDRC permite el análisis del efecto del RNAi sobre un gen determinado en diferentes condiciones, tejidos..

Genética reversa II. Otro ejemplo La efectividad del sistema se ha comprobado mediante reproducción, por RNAi, de los fenotipos causados por mutaciones clásicas

Genética reversa II. Otro ejemplo P-element library (GD) ΦC31 library (KK) Available since Insertion of the UAS-IR Random. Insertions mapped to chromosome X, 2 or 3. Precise locations unknown. Targeted into VIE-260b landing site, chromosome 2, at position (5' to CR33987) Target selection / PCR template designDietzl et al (2007) Nature v448 p151Horn and Boutros (DKFZ, Heidelberg) Hairpin length range/average (bp) (321) (357) Transformation vectorpMF3 (10x UAS)pKC26 (10x UAS) Verification of transformant linesRestriction digestSanger sequencing Coverage 16,763 lines 11,292 genes (81%) Average of 1.2 lines/gene 9,822 lines 9,646 genes (69%) Average of 0.7 lines/gene Activity Soma and germline. Enhanced by co- expression of Dicer2 Genome-wide RNAi libraries (GD and KK) El VDCR dispone de stocks de moscas UAS-RNAi que cubren en conjunto >90% de los genes de Drosophila

Genética reversa II. Otro ejemplo A Global In Vivo Drosophila RNAi Screen Identifies NOT3 as a Conserved Regulator of Heart Function Cell 141, 142–153, April 2, 2010 En este trabajo se utiliza la colección del VDRC en un screening “genome wide” en el que los RNAi se expresan en corazón, buscando eventos de down-regulation que afecten a la función cardiaca. Se trata de una aproximación de genética directa. ¿Es importante el nivel de expresión final de cada gen diana? Lo que si es importante es tener en cuenta la posibilidad de efectos en otros genes

Genética reversa II. Otro ejemplo De genes conservados en mamíferos El efecto parcial del RNAi es aquí una ventaja

Genética reversa II. Otro ejemplo Un screening preliminar con 80 líneas sirve para determinar el tipo de tratamiento óptimo para descubrir efectos causados por estrés cardiaco En un experimento control, con factores transcripcionales de función probada en corazón (círculos), la mayoría, pero no todos, los knockdown mostraron un efecto.

Genética reversa II. Otro ejemplo En el screening masivo se analizan 7971 líneas, que representan 6751 genes conservados y con potencial función cardiaca. Los candidatos fueron re-testados y en algunos casos se generaron nuevas líneas RNAi para verificar los resultados Finalmente, 490 candidatos mostraron susceptibilidad a estrés cardiaco con Z>3 (>3 desviaciones estándar de la media). Estos genes fueron anotados con GO Junto a genes previamente identificados, el screening identificó un gran número de genes y rutas no asociadas previamente a la función cardiaca

Genética reversa II. Otro ejemplo 5 de los 8 miembros del complejo CCR4-Not aparecen en la colección de líneas con problemas cardiacos

Genética reversa II. Otro ejemplo Genética reversa: el complejo CCR4-Not no ha sido implicado previamente en función cardiovascular pero 5 de los 8 miembros muestran un claro fenotipo y otros dos uno más débil. En una nueva ronda de líneas RNAi, incluyendo construcciones efectoras con otro promotor cardiaco, los datos se confirman

Genética reversa II. Otro ejemplo Las líneas RNAi para not-3 y UBC4 muestran defectos en diversos parámetros de la función cardiaca Y defectos severos en la organización de miofibrillas en el tubo cardiaco

Genética reversa II. Otro ejemplo Estudios de not-3 en ratón y humanos en el siguiente seminario