RNA INTERFERENCE: The story of gene silencing in plants and humans Manhood-ur-Rahman, Imran Ali, Tayyab Husnain, Sheikh Riazuddin National Center of Excellence.

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1 RNA INTERFERENCE: The story of gene silencing in plants and humans Manhood-ur-Rahman, Imran Ali, Tayyab Husnain, Sheikh Riazuddin National Center of Excellence in Molecular Biology (CEMB), 87-West Canal Bank Road, University of the Punjab, Lahore-53700, Pakistan

2 Historia de la interferencia del RNA (RNAi)
Descubierto accidentalmente cuando se inyecto una cadena anti-sentido para bloquear la expresión de el gen par-I en Caenorhabditis elegans. RNA sentido RNA antisentido Sin inyectar Reducción de la expresión Guo S, Kemphues KJ. Par-1 a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 1995;81:611–20

3 Historia de la interferencia del RNA (RNAi)
Años atrás, biólogos experimentaron en petunias con la introducción de gen productor de pigmentos bajo el control de un promotor; para tener flores de color purpuro oscuro. Variegacion Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes intrans. Plant Cell 1990;2(4):279–89.

4 Historia de la interferencia del RNA (RNAi)
En 1998, Fire y Mello finalmente resolvieron el misterio al inyectar un RNA de doble cadena dentro de C. elegans. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Narture 1998;391:806–11.

5 Mecanismo de la interferencia del RNA
dsRNA DICER siRNA (21-24N) AGO2 FMRP P100 RISC mRNA

6 Mecanismo de la interferencia del RNA
Posibles propósitos en la célula: Inhibir la movilización de transposones. Actuar como mecanismo de antiviral en plantas.

7 Silenciamiento de virus en plantas
Mecanismos contra las moléculas de RNA (virales) que pueden causar el silenciamiento de genes: RNA pol. dependiente de RNA implicado en la conversión de ssRNAs en dsRNAs, para su procesamiento por Dicer para generar siRNAs. EL Silenciamiento de RNA en las plantas participan dos especies de siRNA funcionalmente distintas: siRNAs 21N: La escisión de los transcripto blanco mediada por RISC, involucrados en la señalización a corta distancia. siRNAs 25 N: metilación del ADN y la propagación sistémica del silenciamiento. RNAi es una herramienta importante para el análisis de la función génica en el las plantas. Este mecanismo de los objetivos del ARN del genoma viral de la degradación, y como el virus de la transcripción contiene la secuencia de plantas, homólogos ARNm de acogida son también objeto de la destrucción de (Scofield et al., 2005). Los organismos eucariotas han desarrollado un mecanismo para proteger sus genomas contra las moléculas de ARN que pueden causar el silenciamiento de genes. Silenciamiento de ARN se conserva a través de reinos y se manifiesta como sofocar en hongos, la interferencia de ARN (RNAi) en animales, y cosuppression PTGS o en las plantas (Hamilton y Baulcombe 1999, Hamilton et al., 2002; Plasterk 2002). Independientemente de su origen, la aparición de dsRNAs en la citoplasma de las células vegetales induce PTGS. Se ha demostrado de que el ARN polimerasa dependiente de ARN también está implicado en PTGS (Dalmay et al., 2000; Mourrain et al., 2000), probablemente mediante la conversión de ssRNAs objetivo en dsRNAs, que luego se procesados por Dicer para generar siRNAs (Xie et al., 2004). PTGS puede generar señales de silenciamiento con específicos de secuencia información que se transmite de célula a célula a través de plasmodesmos ya través del sistema vascular a los diferentes órganos de la planta de (Mlotshwa et al., 2002; Himber et al., 2003).

8 Silenciamiento de virus en plantas
Las vías de silenciamiento endógeno participan en la regulación génica en a nivel de transcripción, a estabilidad de RNA y el los niveles en la traducción. La maquinaria de RNAi responde a una variedad de elementos que lo activan, incluyendo la infección viral, los transgenes, elementos repetidos  y transposones.  Durante una infección de virus: Acumulación de siRNAs 21N de doble cadena en tejidos locales y sistémicos. Reducción del título viral, y en algunos casos, la inmunidad o la recuperación en hojas superiores no inoculados.   Una característica importante de silenciamiento de ARN en las plantas es la participación de dos especies de siRNA funcionalmente distintas que probablemente surgen de Dicer separado, como las actividades (Hamilton , et al., 2002; Silhavy et al., 2002; Tang et al., 2003). El siRNAs nucleótidos son suficientes para RISC mediada división de las transcripciones de destino y se cree que están involucrados en shortdistance de señalización, mientras que el 25-están asociados siRNAs nucleótidos con la metilación del ADN y la propagación sistémica de la silenciamiento (Hamilton et al., 2002; Himber et al., 2003). Hay varias vías de silenciamiento celular, además de los involucrados en la defensa. Las vías de silenciamiento endógeno tienen importantes  papel en la regulación génica en la estabilidad de la transcripción, el ARN y el  los niveles de traslación (Herr, 2005; Brodersen y Voinnet, 2006;  Vaucheret, 2006). La maquinaria de RNAi responde a una variedad de  desencadenantes, incluyendo la infección viral, los transgenes, elementos repetidos  y transposones. Todos estos factores desencadenantes llevar a silenciar a los resultados  que van desde la degradación del ARNm de la represión de traslación de  la remodelación de la cromatina (Qi y Hannon, 2005).  Los virus de plantas son conocidos como inductores potentes, así como objetivos de  PTGS. Durante una infección de virus, la acumulación de 21 --  siRNA de doble cadena de nucleótidos que se observa en los locales y de  tejidos sistémicos (Hamilton y Baulcombe 1999; Szittya et al.  2002), lo que indica la activación de PTGS. Los niveles elevados de siRNA  se correlacionan con una reducción del título viral, y en algunos casos,  la inmunidad o la recuperación en hojas superiores inoculados (Ratcliff  , et al., 1997; Szittya et al., 2002). Por lo tanto, actúa como un PTGS RNAmediated  respuesta de defensa para proteger las plantas contra la infección viral  (Voinnet 2001; Waterhouse et al., 2001; Moissiard y Voinnet,  2004; Baurle y Dean, 2006).  Secuencias de genes derivados de virus de plantas diferentes han  ha introducido en una gran variedad de especies de plantas para producir  plantas transgénicas protegidas contra las infecciones virales. En un número  de los casos, se sabe que el mecanismo de resistencia es un postranscripcional  (Lindbo et al., 1993; Inglés et al., 1996). RNAmediated  resistencia a los virus es una manifestación de PTGS, una más  fenómeno general que fue descrito por primera vez como una propuesta articulada  y la inactivación del gen de reciprocidad de acogida y codificación de los transgenes  el mismo sentido que el ARN (Vaucheret et al., 1998; Sijen y  Kooter, 2000).  Varios virus de plantas han desarrollado resistencia contra  siRNA y evolucionaron las proteínas que suprimen diversos pasos de las  mecanismo de silenciamiento (Voinnet et al., 1999, y Li Ding, 2001;  Silhavy et al., 2002; Silhavy y Burgyan, 2004). Pero no es  claro cómo la mayoría de las proteínas virales contrarrestar supresor de silenciamiento en  el nivel molecular. Las tres dimensiones-X-estructura cristalina de la radiografía  P19-de un complejo de siRNA reveló que un P19 actúa como un dímero de  de la zapata, la unión de los extremos del dúplex siRNA, mientras que la medición de  su longitud (Vargason et al., 2003, Ye et al., 2003), perturbando así  de su mecanismo de silenciamiento.  Teniendo en cuenta que el proceso de interferencia se produce después de la transcripción  e implica la degradación del ARNm (Montgomery  , et al., 1998; Ong et al., 1998), ARN de interferencia y PTGS en las plantas han  sido propuesto para ser un fenómeno relacionado que podría desempeñar un  papel biológico importante en la protección del genoma del organismo contra extranjeros ácidos nucleicos. Además, el análisis de los mutantes defectos en estos procesos ha puesto de manifiesto la participación de de productos de los genes similares en diferentes organismos (Cogoni y de Macino 1999a; Dalmay et al., 2000; Fagard et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Smardon et al., 2000). Un gran número de evidencias que sugieren que la cuota relacionada con las plantas, animales y levaduras de mecanismos de degradación específica de ARN en la que el doble formas cadena de ARN están implicados (Cogoni y Macino, , 1999b; Sijen y Kooter, 2000).

9 Varios virus de plantas han desarrollado resistencia contra  siRNA y desarrollaron proteínas que suprimen diversos pasos del mecanismo de silenciamiento . P19 es un dímero de reconocimiento, une los extremos del dúplex de siRNA, interrumpiendo el mecanismo de silenciamiento.  La interferencia de RNA y PTGS en las plantas han  sido propuesto para ser un fenómeno relacionado en la protección del genoma del organismo contra extranjeros ácidos nucleicos.  dsRNA

10 Silenciamiento del virus de Hepatitis C (HCV)
El Virus la hepatitis C (VHC) tiene un genoma único ssRNA el cual funciona tanto como un mRNA y de cadena de referencia. Seidentificó siRNAS (60N) en Saccharomyces cerevisiae, que inhibe la región no traducida 5’ (5’UTR).  RNAi es un factor limitante para la infección por el VHC, y además que algunas proteína nucleares suprimen el silenciamiento de RNA basados en la respuesta antiviral.  RNAi dirigida a IRES (Internal Ribosome Entry Site) muestra un fuerte efecto inhibidor sobre la expresión del gen bajo el control de esta secuencia.  5. Silenciamiento de virus de la hepatitis C (VHC)  CVirus la hepatitis (VHC) es un genoma único strandedRNAthat  funciona tanto como un ARN mensajero y una réplica de plantilla,  por lo que es un objetivo atractivo para el estudio de la interferencia de ARN  (Yan et al., 2000; Dai et al., 2000; Song et al., 2001, Cheng et al.,  2001; Meier et al., 2001, Yu et al., 2002; Gaur y Rossi 2006).  La interferencia de ARN representa un nuevo enfoque prometedor para  hacer frente a este problema (Henry et al., 2006). Resultados anteriores de  Izumi et al. (2001) identificó un pequeño (60-nucleótidos) de ARN de  la de la levadura Saccharomyces cerevisiae, que inhibe el virus de la hepatitis C  (VHC) 5'-región no traducida (5'UTR). Ofertas de interferencia de ARN  Además, esperamos para silenciar genes problemáticos. El poder de las pequeñas  ARN para cerrar las actividades de genes específicos que actualmente se ha  para influir en un modelo animal de hepatitis. Ratones infundido con un  siRNA en contra de un receptor de muerte celular recuperado la función hepática  después de una lesión inducida experimentalmente (Song et al., 2003).  Los biólogos han acordado que la mejor estrategia sería apuntar  siRNA directamente a los virus de la hepatitis B o C. Evidencias que sugieren  de que, en placas de Petri, siRNA puede detener virus de la hepatitis C a partir de  replicar (Song et al., 2003). Es bien conocido fenómeno  que RNAi es un factor limitante para la infección por el VHC, y el núcleo  la proteína suprime el silenciamiento de ARN basados en la respuesta antiviral.  Esta capacidad de la proteína central para contrarrestar la defensa del huésped  puede conducir a una infección viral persistente y puede contribuir a la  patogenia de la hepatitis C (Wang et al., 2006, Wilson y  Richardson, 2006; Kusov et al., 2006).  RNAi dirigidas VHC IRES muestra un efecto inhibidor sobre la fuerte  la expresión del gen reportero bajo el control de esta secuencia,  lo que sugiere que el ARNi basada en la estrategia de lucha contra el VHC puede representar un  enfoque de potencial en el tratamiento de la infección por el VHC (Chen et al.  2006). De RNAi es capaz de inhibir la replicación del VHB y de expresión  in vitro e in vivo, y por lo tanto puede constituir un nuevo  la estrategia terapéutica para la infección por el VHB (Wu et al., 2005; Ying  , et al., 2006a, b). Por lo tanto, se puede concluir que, siRNA tiene un importante  potencial para convertirse en un nuevo tipo de medicamentos antivirales (Wu et al.  2005).  ARN interferente pequeño sintéticas podrían suprimir el transgén  expresión en ratones adultos y ARN horquilla pequeña transcrito en  in vivo a partir de ADN de plantillas. Algunos científicos también mostró la  potencial terapéutico de esta técnica mediante la demostración de  la orientación eficaz de una secuencia del virus de la hepatitis C por el  La interferencia de ARN in vivo (McCaffrey y Kay 2002; McCaffrey  , et al., 2002). La interferencia de ARN bloqueada la expresión génica y de  La síntesis de ARN de la hepatitis C se propaga en replicones humanos  las células del hígado. De doble cadena moléculas siRNA diseñado para atacar  el genoma del VHC fueron introducidas a través de electroporación en  un ser humano línea celular de hepatoma (Huh-7) que contenía un VHC  sub-replicón genómica. Dos siRNAs reducido drásticamente virusspecific  la expresión de proteínas y la síntesis de ARN a niveles que  fueron 90% menos que los observados en las células tratadas con los negativos  el control de siRNA (Wilson et al., 2003).  La utilidad de siRNA como una terapia contra la infección por VHC  dependerá del desarrollo de sistemas de administración eficiente, que  inducir la actividad de larga duración RNAi (Randall et al., 2003). El VHC es  un objetivo atractivo para su localización en el hígado, un órgano que puede  ser fácilmente el blanco de moléculas de ácido nucleico y vectores virales. En  , el futuro de siRNA sintético modificado químicamente, con la mejora de  la resistencia a nucleasas, junto con una mayor duración de RNAi,  puede convertirse en una posibilidad para aplicaciones terapéuticas. Sobre la base de  los experimentos anteriores, el uso de siRNA como un tratamiento para el VHC  infecciones tiene un gran potencial para su uso solo o en combinación con  la terapia con interferón convencional (Zamore y Aronin 2003).  , Como agentes terapéuticos, siRNAs tienen propiedades notables.  Sus acciones parecen ser de corta duración en los mamíferos. Son  productos específicos de secuencia, natural y celulares y puede, por tanto,  no producir metabolitos tóxicos. Sin embargo, la entrega de siRNA  a las células adecuadas es un reto importante. Una mejor prestación de  métodos, tales como la formulación de siRNA con compuestos que  promover el tránsito a través de las membranas celulares son claramente necesarias antes de  siRNA pueden ser utilizadas en terapia, especialmente para suprimir gen  expresión en otros tejidos que en el hígado.

11 La interferencia de RNA bloquea la expresión génica y la síntesis de RNA de replicones VHC de la hepatitis C se propaga en replicones humanos las células del hígado. Dos siRNAs en introducidos celulas Huh-7 reduce drásticamente la expresión de proteínas y la síntesis de RNA en un 90%. Ventajas Desventajas Son productos específicos de secuencia, natural y celulares. Su acción es de vida corta en mamíferos (mejora de la resistencia a nucleasas).  No produce metabolitos tóxicos. No se tienes buenos métodos para el trasporte de los siRNA hacia células blancos. Es capaz de inhibir la replicación del VHB y de expresión in vitro e in vivo.

12 Silenciamiento de HIV siRNAs pueden inhibir la producción de virus en cultivo celular, mediando su degradación y disminuyen la expresión del genoma viral. siRNAs regula la expresión del receptor CD4 y de los co-receptores CXCR4 celulares y CCR5, previniendo la entrada de VIH-1. 6. El silenciamiento del virus de inmunodeficiencia humana (VIH)  La interferencia de ARN representa una nueva y emocionante tecnología que  pueden tener aplicaciones terapéuticas en el tratamiento de la inmunodeficiencia humana  virus (VIH). Los informes anteriores han demostrado que  siRNA dirigido contra el genoma del VIH pueden inhibir eficazmente  la producción de virus en la célula sistemas de cultivo y la actividad de RNAi  dirigida hacia el receptor de las principales proteínas del VIH, CD4, llevó a  disminución de la entrada del VIH en las células (Park et al., 2002; Capodici  , et al., 2002; Huelsmann et al., 2006; Rossi, 2006; Gaur y  Rossi, 2006). siRNAs contra la co-receptores CXCR4 celulares y  CCR5 había demostrado que establecen la regulación de estas moléculas de la superficie de  podría prevenir el VIH-1 de entrada y confieren resistencia viral  (Anderson y Akkina, 2005). Al dirigirse a varias regiones de  el genoma del VIH-1, Jacques et al. (2002) mostró siRNA  mediada por la degradación del genoma viral y por la regulación de la  expresión de los genes virales. Además se demostró que trabajó RNAi  aun cuando el genoma viral contenida en el nucleoproteína  complejo. También demostraron que siRNAs intracelular  funcionó bien, proporcionando las formas posibles para la entrega de terapia génica  agentes contra el VIH. Para evaluar los efectos de RNAi sobre el VIH-1  infección, Novina et al. (2002) se dirigieron tanto a celulares y virales  ARN.  Estudios recientes muestran que siRNA pueden inhibir la replicación viral  en varias etapas de la infección, incluidas las fases muy tempranas, cuando  los virus son más vulnerables. Orientación o genes virales o de acogida  los genes que están involucrados en el ciclo de vida del virus también puede bloquear el  la infección. Se ha demostrado que siRNA dirigido contra el VIH-1  tiene el potencial de ser tratamientos útiles (Lee et al., 2002).  Martínez et al. (2002) encontró que la supresión de las quimiocinas  la expresión del receptor de la interferencia de ARN, podría inhibir el VIH-1replicaciónreplicación. Ya se estudió que siRNAs contra correceptores celulares CXCR4 y CCR5 había mostrado por la regulación de estas moléculas de la superficie y por lo tanto podría prevenir el VIH-1 de entrada y confieren resistencia viral. Tanto CXCR4 y CCR5, receptores podría ser a la vez blanco de abajo por un reglamento único vector de lentivirales combinatoria incorporar respectivos anti-siRNAs correceptor (Anderson y Akkina, 2005). Gitlin et al. (2002) informó de que siRNA específicos administrados a las células humanas desde el exterior, como una droga, podría entrar en ellos y protegerlos contra la infección por el virus de la polio se multiplican con rapidez. Jacques et al. (2002), en tanto, informó similares los resultados en sus estudios con el VIH-1. Estos autores demostraron además que si el siRNA se expresaron en el interior de las células, en lugar de limitarse a administrar desde el exterior, las células de se convirtió en gran medida inmune al VIH subsiguientes-1. Estos resultados son emocionante, y sugieren que el ARNi es perfectamente adecuada para muchos aplicaciones antivirus y objetivos de los genes del VIH con siRNA podría ser una estrategia eficaz para la gen -

13 siRNA pueden inhibir la replicación viral  en varias etapas de la infección, incluidas las fases muy tempranas.  siRNA específicos administrados a células humanas desde el exterior, como un fármaco, protegiendo contra la infección por el VIH se multiplican con rapidez. si el siRNA se expresara en el interior de las células, en lugar de limitarse a administración desde el exterior, las células se volverían inmunes al VIH -1. 

14 Interferencia del RNA en Cáncer
En implementación de siRNA en la terapia del cáncer: Modelos animales y vectores virales con cassettes de expresión. Combinación de técnicas: siRNA dirigidos a HIF-1 con radiación ionizante. Complejos de siRNA Anti-bcl-2 con liposomas (lipidos cationicos) en el modelo de ratón de metástasis hepática. Administración de siRNA Anti-PLK-1/liposoma en modelo de ratón de cancer de vejiga.  siRNA combinado con Anticuerpos especificos: Anticuerpos anti- ErbB2 unido a un siRNA en las células de cáncer de mama. 7. La interferencia de ARN en la terapéutica del cáncer  La aparición de la interferencia de ARN (RNAi) como un mecanismo de  para suprimir la expresión de genes ha revolucionado la genética en mamíferos  las células y ha comenzado a facilitar las funciones de decodificación de genes  en una escala del genoma (Westbrook et al., 2005). Para desarrollar siRNAfor  la terapia del cáncer, varios investigadores han investigado en siRNAs  modelos animales. Para obtener eficiente y de larga duración silenciamiento de genes  mediante RNAi, varios grupos han incorporado el siRNA  casetes de expresión en una variedad de vectores virales.  Zhang et al. (2004) demostraron que la inyección intratumoral de un  el adenovirus que codifica el factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1) --  siRNA dirigidos tenido un efecto significativo sobre el crecimiento del tumor cuando  combinado con la radiación ionizante. Aunque la experiencia pasada con  ribozimas sugieren que la mayoría de los lípidos catiónicos (liposomas) la entrega  los sistemas son demasiado tóxicos cuando se usa en vivo. Algunas empresas han  desarrollado nuevos liposomas catiónicos que pueden ser administrados  de forma segura en vivo. Anti-bcl-2 siRNA complejo con liposomas tenía un  fuerte actividad antitumoral cuando se administra por vía intravenosa en el  modelo de ratón de metástasis hepática (Yano et al., 2004).  Además, Nogawa et al. (2005) informó de que intravesical  de inyección de Polo-como quinasa-1 (PLK-1) liposomas siRNA / con éxito  impedido el crecimiento del cáncer de vejiga en un ortotópico de  modelo de ratón. Un método atractivo es a través de la entrega de la  siRNA células cancerosas utilizando anticuerpos específicos. Un anticuerpo contra la  oncogén erythroblastic leucemia viral homólogo 2 (ErbB2)  fusionado a un fragmento concreto de protamina y eficaz entrega  ErbB2 siRNA sólo a las células de cáncer que expresan de mama (Song  , et al., 2005).  Factor inducible por hipoxia 1 (HIF-1) es el mediador central de la  las respuestas celulares a bajo nivel de oxígeno y se ha convertido recientemente en una  objetivo terapéutico importante para el tratamiento de tumores sólidos (Tan et al.  2005). La interferencia de ARN modelo basado en la caída inducible  puede ser una valiosa plataforma para la posterior evaluación de la combinación de  tratamiento de las terapias contra el cáncer con otras HIF-1  (inhibición de Li et al., 2006) porque inducible ARNi es un versátil  herramienta para la evaluación de los objetivos de cáncer in vivo (Li et al., 2005).  Aunque la entrega del siRNA sistémica impone varios requisitos  y mayores obstáculos que la entrega del siRNA locales. Enfermedades  como el cáncer se consideran como enfermedades sistémicas, incluyendo metastásico  distribución de las células microdisseminated, y por lo tanto requieren  el tratamiento sistémico con siRNA (Takeshita y Ochiya, 2006).  En un futuro próximo la entrega sistémica de siRNA se  necesario, posiblemente utilizando un tejido específico de células o genes específicos  vector de promotor o de anticuerpos específicos conjugados los transportistas, lo que  la reducción de la dosis aplicada de siRNA y la consiguiente disminución en el lado  efectos (Takeshita y Ochiya, 2006). Específicas de orientación,  la angiogénesis y la metástasis puede ser explotado por las diferencias  entre las células cancerosas y las células normales, que incluyen  la proliferación descontrolada, la insensibilidad a un crecimiento negativo  Reglamento y señales anticrecimiento (Takeshita y Ochiya, 2006).

15 Modelos Knock-Out basados en RNAi en combinación con terapias de inhibición de HIF-1 (cáncer in vivo). Enfermedades como el cáncer se consideran como enfermedades sistémicas, por lo tanto requieren el tratamiento sistémico con siRNA. Utilizando de vectores de genes promotor específicos (tejido o células). Anticuerpos específicos unidos a moléculas transportadoras, reduciendo dosis y efectos colaterales.

16 Ventajas de interferencia de RNA
Desempeña un papel en la protección celular frente a virus y transposones en plantas e insectos.  dsRNA activa procesos normales que conducen a la degradación del RNA, así como de propagación del silenciamiento célula-célula. Ayuda a mejorar el análisis genético de varios modelos tradicionales de organismo. Regular la expresión génica, evaluando sus funciones fisiológicas en las plantas y seres humanos (Knock-Modelo). 8. Ventajas de ARN de interferencia Una de las ventajas específicas de RNAi sobre otros métodos previamente empleado es el dsRNA activa un celular normal proceso que conduce a la degradación del RNA muy específicas y quizá más importante, de una célula a célula difusión de este gen efecto silenciador en varios modelos de RNAi (Shuey et al., 2002). Ello también es un método relativamente rápida de mejorar el análisis genético de de los organismos modelo tradicional y ha proporcionado un medio de realización de experimentos de genética inversa en los organismos que carecen los instrumentos establecidos genéticos (Zamore et al., 2000). RNAi actividad desempeña un papel en la acogida de protección celular frente a virus y transposones en plantas e insectos. Desde una perspectiva práctica, RNAi por lo que pueden ser usadas para dirigir la expresión génica y ha ha demostrado ser una técnica muy poderosa para derribar genes específicos para evaluar sus funciones fisiológicas en las plantas y los seres humanos (Schwarz et al., 2002, Williams y Rubin, 2002, GE , et al., 2003; Kamath et al., 2003).

17 Usos potenciales de RNAi
Terapia en el silenciamiento de genes basado en dsRNA. Método fiable y rápido para la creación de mutantes y la realización de estudios de genes Knock-out y perdida de fenotipo. Evaluación de funciones de proteínas, como el descubrimiento de enzimas y proteínas implicadas en determinadas vías metabólicas (acido Abscísico/ Giberelinas). Inducción de RNAi por transcripción bi-direccional de un gen en particular o el flankeo de un gen para ser silenciado por dos promotores convergente. 9. Los usos actuales y potenciales de RNAi La tecnología de ARNi ha sido descrita como "no sólo es un muy poderoso instrumento de análisis funcional del genoma, sino también como un método potencialmente útil para desarrollar altamente específico dsRNA terapéutica basada en el silenciamiento de genes "(Shuey et al. 2002). Dado que los resultados de interferencia de ARN en una célula u organismo que carece de una transcripción en particular, los biólogos tienen bastante método fiable y rápido para la creación de mutantes y la realización de "Knock-out de genes" y "pérdida de fenotipo" estudios (Shuey et al. 2002). Hay muchos ejemplos de experimentos en los que RNAi es utilizados para evaluar las funciones de las proteínas y en particular para ayudar en la el descubrimiento de lo que las enzimas y las proteínas están implicadas en el determinadas vías metabólicas como en el Abscisic / giberelinas acidsignalling (vía Zentella et al., 2002). Otro tipo de experimento que se está haciendo actualmente consiste en los intentos de inducir a la interferencia de ARN por bi-direccional de la transcripción de un gen de interés en particular o por el gen de acompañamiento a callar por dos promotores convergente (Bieri et al., 2002). Hasta ahora hemos visto que el ARN de interferencia puede ser extremadamente herramienta genética valiosa cuando se estudian las plantas, insectos y pequeños invertebrados, como los nematodos. Sin embargo, los biólogos estánsiempre de cara a cómo los nuevos descubrimientos pueden beneficiarse los seres humanos, por lo que esto ha dado lugar al estudio de si o no RNAi también se produce en células de mamíferos. RNAi podría potencialmente ser utilizado como una forma de terapia génica? Dos problemas se inicialmente detectado cuando se introdujeron las largas cadenas de ARN bicatenario en células de mamíferos. Estos dos obstáculos se deben a de la respuesta antiviral de la célula contra el dsRNA extranjeros. Uno de los problemas es la activación de una proteína quinasa PKR, que los puestos de traducción mediante la fosforilación de un factor de iniciación, eIF2a. El otro problema a la dsRNA es la activación de la RNasa L, una enzima que degrada el ARNm de la célula en un no de manera específica a la inducción al dsRNA (Elbashir et al., 2001b). Elbashir et al. (2001b) llevó a cabo una serie de experimentos en que en lugar de introducir se encuentra en dsRNA largo de los mamíferos células que presentó menor nucleótidos pequeñas ARN interferente. El 21-nucleótidos dúplex siRNA se cotransfected junto con un gen en un plásmido y insertar en las células de Drosophila S2 o células de mamífero. La mayoría de los siRNAs eficientes resultaron ser de 21 nucleótidos de longitud (Elbashir et al., 2001a, b). Estos resultados, concluyó que nucleótidos siRNAs no provocan la respuesta antiviral y la abrió un nuevo curso de acción conjunto para el estudio de genes terapéutica.

18 El empleo de RNAi en estudio de células de mamíferos se obstaculizado por 2 problemas:
Activación de una cinasa (PKR), que retrasa la traduccion mediante la fosforilación de un factor de iniciación (eIF2a). Es la activación de la RNasa L, la cual degrada el ARNm de la célula de manera no específica a la inducción al dsRNA.

19 Direcciones a futuro Posible vínculo con la inactivación del cromosoma X, impronta e interferones se ha sugerido, pero aún no está firmemente establecida.  Un mejor estudio sobre el PTGS permitirá una respuesta mas eficiente contra infecciones virales y el desarrollo de asociaciones trasgene/huesped que anulen el silenciamiento de permitir la expresión de proteínas de interés.  Establecer una inmunización intracelular mediante el uso de sRNA en lugar de proteínas. El potencial RNAi para el tratamiento de enfermedades virales y el cáncer se ha despertado un gran interés en el ámbito científico (VIH, VPH, poliomielitis o genes cancerígenos). 10. Direcciones futuras  El campo de RNAi se está moviendo a un ritmo impresionante y  la generación de resultados interesantes que están claramente asociados con el ARN  la interferencia, silenciamiento del transgén y la movilización de transposones  (GAAM 2002; Couzin 2003). Posible vínculo con el cromosoma X  la inactivación, la impronta y la respuesta de interferón también se han  sugerida, pero aún no está firmemente establecida. RNAi también tiene un  potencial económico considerable, especialmente en la agricultura. Un  una mejor comprensión de PTGS debería permitir una más eficiente  la respuesta a la infección viral y el desarrollo de los transgenes /  las asociaciones de acogida que puede anular el silenciamiento de permitir la expresión de  de proteínas de interés.  En los próximos 10 años, RNAi probablemente será considerada como una  de los principales avances del siglo 21. En relación con la  Interferencia de ARN en los mamíferos, es importante señalar que en  a diferencia de la secuencia del efecto de RNAi específicos observados en  de embriones de ratón, este nuevo estudio ha demostrado que la incubación de una  lisados de reticulocitos de conejo y de mRNAwith dsRNA induce inespecíficos  la degradación del ARNm, una posible razón para esta diferencia  podría ser la respuesta de interferón presentes en reticulocitos de conejo  de lisado no es funcional en los embriones tempranos de ratón  (Yamamoto et al., 2002; Couzin 2002).  Aunque la tecnología de RNAi antivirales aún no ha sido optimizado,  el fenómeno parece ser general y eficaz.  En 1988, el concepto de immunizationq qintracellular  Se propuso, por el que se podía expresar dentro de las células inhibidoras  moléculas (usualmente proteínas) que podrían proteger a estas células  de las infecciones virales en el futuro (Li et al., 2002; Zhang  , et al., 2002, Cheng et al., 2002; Hao et al., 2003; Jia et al., 2003;  Cheng et al., 2003; Liang et al., 2003; Sun et al., 2003a, b;  Zhang et al., 2003). La promesa de la inmunización intracelular de  ahora parece estar más cerca de la realidad mediante el uso de las pequeñas  ARN en lugar de proteínas (Li et al., 2006). El potencial de la  mediante la actividad de RNAi para el tratamiento de enfermedades virales y  el cáncer se ha despertado un gran interés en el ámbito científico  (comunidad de Li et al., 2005; Ying et al., 2006a, b). Muchos  laboratorios han reportado el uso de la actividad de RNAi en los cultivos de  de células infectadas con el VIH, el virus del papiloma humano, y la poliomielitis o la  que contiene una variedad de genes del cáncer. Las aplicaciones clínicas de  RNAi están a la vuelta de la esquina.