TPN°1: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Bqca. Marcela Alejandra Guastavino – Lic. María Mercedes Tiscornia. CÁTEDRA DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA. FCEQyN. UNaM.

Dogma central de la biología molecular

Estructura del ADN El ADN se encuentra en el núcleo (en eucariotas) o en el citoplasma (en procariotas) y es la molécula que contiene toda la información genética necesaria para construir un organismo y para que éste funcione como lo hace.

Material de partida Bacterias, vegetales, animales y humanos

Pasos para la extracción de Ácidos Nucleicos. Eliminación de Eritrocitos. Ruptura de la Pared y Membrana Celular Purificación Precipitación Lavado, Rehidratación y Almacenamiento

Equipos para Lisis celular

LISIS DE GLÓBULOS ROJOS Sacarosa: aporte osmótico ejercido por la sacarosa permitirá la ruptura de las membranas del glóbulo rojo. Tritón X100detergente para desorganizar las membranas biológicas, permitiendo la ruptura de las mismas. Tris: éste es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3- propanodiol) para la preparación de diversos tampones, y como agregado en reactivos de lisis, purificación, y resuspensión de ácidos nucleicos. Realizamos sucesivos lavados y recuperamos el pellet con los glóbulos blancos.

Ruptura de la pared celular El tiempo consumido en la destrucción de la pared celular es suficiente para que la activación de enzimas provoque la pérdida del material genético. Es importante tener congelados los morteros, los brazos de morteros, los microtubos donde depositaremos la muestra pulverizada y todo elemento que se pondrá en contacto con la muestra hasta que se le adicione la solución de extracción en caliente. En hongos y bacterias la lisis de la pared celular se puede realizar también mecánicamente. Debemos tener la precaución de trabajar a las más bajas temperaturas posibles y con la mayor velocidad.

Componentes para lisar la célula Tris: éste es un compuesto básico (2-amino-2-(hidroximetil)-1, 3- propanodiol) para la preparación de diversos tampones. EDTA: es el ácido etilendiaminotetraacético, y generalmente se provee en forma de sal disódica. Está incluido en muchos buffer de extracción para quelar cationes divalentes tales como Mg 2+ o Ca2+, los cuales son cofactores de enzimas que degradan el ADN. Sin embargo, existe una ADNasa que es estimulada por EDTA. Cloruro de Sodio: las sales se agregan a los fines de estabilizar el medio salino y además para coadyuvar a la lisis de las paredes celulares vegetales o a las membranas biológicas en caso de las muestras de mamíferos. Las sales aumentan el poder iónico de la solución y ocasionan la precipitación de ADN. Se ha observado que concentraciones más elevadas de este compuesto pueden ayudar a la eliminación de polisacáridos.

Otros compuestos que lleva la lisis según el material de partida Dentro del buffer utilizado variamos los detergentes, CTAB y SDS, que ya han sido utilizados en métodos de extracción existentes. El detergente actuará formando micelas con los componentes lipídicos de las membranas biológicas. El agente reductor, β-mercaptoetanol, es incluido en buffer de extracción para proteger el ADN contra quinonas, bisulfitos, peroxidasas y polifenoloxidasas. Podría ayudar a eliminar los polisacáridos que son contaminantes, que usualmente se piensa que coprecipitan con el ADN. Proteinasa K, es una enzima que cliva específicamente las uniones peptídicas que involucran a aminoácidos alifáticos, aromáticos o hidrofóbicos. La temperatura óptima que se encuentra entre 55- 65ºC. La actividad de ésta enzima puede ser aumentada por la adición al medio del detergente SDS (dodecil sulfato de sodio).

CTAB-NaCl Diferencias en la solubilidad de ácidos nucleicos y polisacaridos en presencia de CTAB ayuda a la eliminación de la contaminación con polisacáridos. Adicionalmente el CTAB puede ser usado para precipitar el ADN cuando la concentración de NaCl es <0,7M.

Concluimos para Lisis La presencia de detergentes, agentes quelantes de metales divalentes, y proteasas estables tales como la proteinasa K durante el proceso de aislamiento, previene cualquier hidrólisis del DNA por nucleasas celulares y asegura el aislamiento de DNA intacto.

Purificación: Remoción de las proteínas PROTEINASAS: esto se agrega en la lisis celular SOLVENTES ORGÁNICOS SALES PROTEINASA K ALTA CONCENTRACIÓN CLOROFORMO:ALCOHOL ISOAMÍLICO FENOL FASE ACUOSA INCUBAR DE 55 A 65°c FASE ORGÁNIA SALTING OUT

Otros agentes de purificación Las concentraciones elevadas de agentes caotrópicos como las sales de guanidinio y la urea permiten que las moléculas de agua penetren en las proteínas, desorganizando así las interacciones hidrofóbicas que estabilizan por lo común la conformación nativa.

Kit de purificación Tiosianato de guanidina, tiene 2 propiedades útiles para la purificación de ADN. Primero, desnaturaliza y disuelve todos los otros compuestos menos los ácidos nucleicos por lo que virtualmente puede ser usado para rescatar el ADN de cualquier tejido. Segundo, en la presencia de tiocianato de guanidina el ADN se une a la sílica por lo que esta propiedad se aprovecha para aislar el ADN por cromatografía por columna y el ADN es recuperado adicionando agua ya que esta desestabiliza las interacciones entre esta molécula y la sílica.

Precipitación Lavado, Rehidratación y Almacenamiento Los alcoholes disminuyen la solubilidad del DNA. Tras la precipitación y centrifugación, podemos obtener un pellet, que representa el DNA concentrado y en condiciones de pureza. Lavado, Rehidratación y Almacenamiento Lavado con etanol al 70% Rehidratación con Agua destilada libre de nucleasas Almacenamiento a -20°C

Extracción de RNA para RT-PCR El RNA es una molécula monocatenaria que no presenta conformación estructural de órden superior. Eventualmente algunos RNAs alcanzan algún tipo de estructura secundaria en regiones de la molécula, gracias al plegamiento de su única hebra sobre sí misma. En líneas generales deberemos romper la membrana plasmática, pared celular vegetal o bien pared celular bacteriana, haciendo uso de las mismas metodologías expuestas anteriormente. Sin embargo tendremos que tener en cuenta la labilidad de la molécula de RNA.

Extracción de RNA: Trizol El reactivo Trizol (Invitrogen) es un agente listo para usar, que consiste en una solución monofásica de isotiocianato de guanidinio y fenol. Detergentes Sarkosyl Triton X

Extracción de RNA

EVITAR DEGRADACIÓN DE RNA Dietilpirocarbonato (DEPC) Inactiva las ribonucleoproteinas por unión covalente Trabajar en un ambiente libre de Rnasas. Usar guantes a lo largo de todo el proceso. Trabajar rápido para evitar la degradación del RNA durante la manipulación.

EXTRACCIÓN DNA Vs. RNA ETAPA DNA RNA LISIS CELULAR CTAB, SDS, Tris-HCl, EDTA, β-MERCAPTOETANOL SARKOSYL, TRITÓN X, ISOCIANATO DE GUANIDINA, FENOL PURIFICACIÓN PROTEINASA STES. ORGÁNICOS SALES CLOROFORMO PRECIPITACIÓN ALCOHOLES ALCOHOLES + SAL LAVADO ETANOL 70% REHIDRATACIÓN TE Ó H2O H2O TRATADA CON DEPC ALMACENAMIENTO -20° C -70° C

Microtubo con ovillo de DNA

Pasos para la extracción de Ácidos Nucleicos. Eliminación de Eritrocitos. Ruptura de la Pared y Membrana Celular Purificación Precipitación Lavado, Rehidratación y Almacenamiento

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