Técnicas de muestreo para el control microbiológico. Dra. Keiko Shirai

Muestreo Es la sucesión de pasos para asegurar que la muestra  posea las características esenciales del lote. Muestra Una porción de material tomada y seleccionada de tal forma que sea representativa del lote (IUPAC).

La muestra seleccionada para el análisis debe ser representativa del lote entero del alimento y lo suficientemente grande para poder llevar acabo todas las determinaciones. La técnica de análisis sea ejecutada con estricto apego a la metodología establecida. Comparación con normas o estándares de calidad

Para realizar un muestreo en forma práctica se utiliza el "Sentido Común". La experiencia de los procesos de fabricación permite que el muestreo puede resolverse al tanteo. Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al final de la jornada; Ejemplo 2: tomando como muestra el último producto de cada serie (como se hace con algunos alimentos precocidos y congelados).

Desde el punto de vista microbiológico…. ¿Cómo debo de realizar el muestreo? ¿Qué cuidados debo de tener para evitar un resultado erróneo?

Criterios Generales de Muestreo. estéril y envuelto evitar contaminación del ambiente. rotular o etiquetar. Consignar información

transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeración o en congelación. evitar agua de deshielo reducir tiempo comprendido entre recolección y entrega de la muestra. muestras líquidas deben encontrarse homogéneas

¿Cómo manejar una muestra sólida? ¿Cómo evitar heterogeneidad?

Para muestras sólidas se recomienda un peso de 100 gramos a granel o en recipientes o piezas grandes integrar una muestra representativa pueden tomarse muestras de la superficie y profundas obtención de muestras superficiales usar líquidos de dilución con bajo potencial redox para anaerobios estrictos

en alimentos congelados

Una vez que tengo la muestra estoy listo para trabajar… Pero cómo empezar…

Técnicas de manejo de muestras. Recuento en placa Número más probable Reducción de colorantes Recuento directo al microscopio Técnicas de manejo de muestras.

Recuento en placa: Dilución para conteo de microorganismos viables Si es muestra líquida congelada fundirla y homogeneizarla. evitar escurrimientos para muestras sólidas se licua o se puede usar un mortero estéril. El volumen que se transfiere nunca será menor del 10% de la capacidad total de la pipeta,

¿Cuántas pipetas estériles deberé de utilizar para evitar contaminación y error?

Cuenta en placa Consiste en contar colonias que se desarrollan después de cierto tiempo presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra. Vertido Superficie

Reglas para conteo en placa 30 a 300 colonias Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas se multiplica por 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el número de cuadros que ocupa la caja. Multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución Redondear la cifra obtenida a dos dígitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130 2,417 se reporta 2400 49 se reporta 49

Diluyentes de uso general Agua peptonada 0.1% pH 6.8-7 Solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7 Solución de Ringer Medio enriquecido para clostridios Solución de sacarosa al 20% o NaCl al 15%, osmófilos y halófilos respectivamente.

Factores que afectan el recuento en placa Métodos de muestreo Distribución de los microorganismos en el alimento Naturaleza de la flora del alimento Naturaleza del alimento Antecedentes del alimento previos al examen Adecuación nutricional del medio utilizado para el cultivo en placas Temperatura y tiempo de incubación pH, aW y potencial de óxido reducción Tipo de diluyente Número relativo de microorganismos en la muestra Existencia de otros microorganismos competidores o antagonistas

Número más probable: Recuento en tubo supone una concentración de microorganismos pequeña estimación estadística de la densidad de bacterias en el alimento permite la inclusión de agentes selectivos

Pruebas presuntivas se utiliza como una etapa de enriquecimiento que busca aumentar la concentración de microorganismo de interés. Se considera positivos aquellos que después de incubados presenten enturbiamiento, cambio de color, formación de gas.

Ejemplo para coliformes Caldo Lauril sulfato Fermentación de carbohidratos como caldo lactosado.

Pruebas confirmativas De los tubos positivos de la prueba presuntiva se inoculan a la prueba confirmativa. El número de tubos positivos y negativos determinará el Número Más Probable Ejemplo para coliformes caldo EC.

Tabla Número Más Probable

Número Más Probable

Ventajas Desventajas Sencillo Es más probable que los resultados coincidan entre laboratorios a diferencia del recuento en placa. Con medios selectivos y diferenciales se puede determinar el número de microorganismos a que grupo pertenecen. Desventajas Gran cantidad de material No se puede observar la morfología de las colonias Poco exacto

Método de la reducción de colorantes Se basa en el tiempo transcurrido para que tenga lugar la reducción del colorante es inversamente proporcional al número de microorganismos existentes en la muestra.

Resazurina Azul pizarra al rosa o al blanco morada rosa dihydroresorufin blanco

Azul de metileno

Ventajas Sencillas, rápidas, baratas y solamente las células viables reducen los colorantes. Desventajas Las sustancias reductoras propias de los alimentos pueden afectar el resultado. No todos los microorganismos reducen de igual modo los colorantes.

Recuento directo al microscopio Consiste en: Frotis de la muestra ó cultivo en portaobjetos Tinción mediante un colorante Observación al microscopio y recuento

Para calcular el número de microorganismos por ml de la muestra: Calcular el promedio contado por cada cuadro Multiplicar el promedio por 10,000 para obtener el número de células por ml de la muestra diluida. Multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.

Ejemplo Suponga que diluyó la muestra original (0.1 ml) en 9.9 ml de diluyente La cuenta en 5 de los 25 cuadros grandes fue de 132 y 128 células.

Ejemplo resuelto El promedio de células fue de 130 x 5 o 650 células por área contada (650 células por 0.1 microlitro). Multiplicamos las 650 células por área contada por 10,000 para obtener el número de células/ml de muestra diluida (6,500,000) Multiplicamos 6,500,000 cells/ml por 100 (factor de dilución) para obtener 650,000,000 por ml of muestra original.

Ventajas Desventajas Sencillo y rápido Se puede apreciar la morfología Cansado Se cuentan viables y no viables Las partículas del alimento no siempre pueden ser diferenciados sustancias Las células microbianas no están distribuida uniformemente con respecto a células aisladas. Algunas células no se tiñen bien. Conteos elevados.