Videos de motivación: 1. E. coli la bacteria asesina https://www

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1 Videos de motivación: 1. E. coli la bacteria asesina https://www
Videos de motivación: 1. E. coli la bacteria asesina 2. Identificación de bacterias mediante la tinción Gram Ing. Carlos Elías P.

2 Cocos Gram (+) Bacilo Gram (-) Ing. Carlos Elías P.

3 MÉTODOS DE DETECCIÓN DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA
Ing. Carlos Elías P.

4 Introducción La elección de los métodos de laboratorio a utilizar para la detección de contaminación microbiana debe privilegiar: A aquellos métodos estandarizados y de alta sensibilidad Validados por organismos internacionales o nacionales. Primeramente, para implementar cualquier método de detección, se requiere preparar las muestras del alimento. Generalmente consiste en la elaboración de diluciones. Ing. Carlos Elías P.

5 Diluciones La bacteria que se quiere identificar está presente en cantidades mucho mayores que otras con las que se encuentra mezclada. De tal manera que, se procede a elaborar una solución madre. Que consiste en colocar el material con el microorganismo en un recipiente que contiene 10 ml de agua destilada estéril con 0.01 % de Tween 80 (emulsionante que evita la oxidación). Cuya suspensión resultante se debe agitar por 1 minuto. A esta suspensión se le llama solución madre. Ing. Carlos Elías P.

6 Diluciones de la solución madre
A partir de la solución madre, se preparan diluciones en serie (10-1, 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6) Ing. Carlos Elías P.

7 Aislamiento de microorganismos
El aislamiento es una etapa importante en el estudio de microorganismos. Comprende la separación de aquél organismo de interés con respecto a otros. Pasos: Muestreo Tratamiento de la muestra Enriquecimiento Aislamiento Manutención y preservación de los microorganismos Ing. Carlos Elías P.

8 1. Muestreo Garantiza que contemos con el material más idóneo del microorganismo que estamos estudiando. Consiste en tomar la muestra, utilizar los materiales requeridos y preparar las diluciones. Ing. Carlos Elías P.

9 2. Tratamiento de la muestra
Una vez que se tienen las diluciones de las muestras que se han tomado, se procede a la siembra en medios de cultivos. Hay una gran variedad de medios de cultivos, la selección de uno u otro dependerá del microorganismo. Una vez que se tienen los resultados de la siembra se procede a la selección de colonias. Ing. Carlos Elías P.

10 …2. Tratamiento de la muestra
Criterios para la selección de las colonias: La cepa debe estar libre de contaminantes. Sus requerimientos nutricionales deberían ser satisfechos (medios de cultivo) Debería llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto. Si el objetivo del proceso es un producto, éste debería ser de alto rendimiento y de fácil extracción del medio de cultivo. Se resiembra las colonias para su purificación. Manejar adecuadamente los cultivos puros (con un solo tipo de bacteria perteneciente a una misma especie) para no contaminarlos. Ing. Carlos Elías P.

11 3. Enriquecimiento Está orientado a obtener un mayor número de colonias del microorganismo que se está tratando de aislar. Se logra mediante el uso de determinados medios de cultivo que cumplen los requerimientos particulares del microorganismo. Ing. Carlos Elías P.

12 4. Aislamiento Se orienta a la detección de determinados microorganismos. Se basa en el empleo de ciertas características que le son propias. Se pueden utilizar por ejemplo, colorantes y determinadas sustancias Ing. Carlos Elías P.

13 5. Manutención y preservación de microorganismos
Este tiene el propósito de poder conservar los cultivos puros. El conservarlos conlleva: Preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades bioquímicas. Preservar los niveles de su productividad inicial. Lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Se han desarrollado varias técnicas de conservación entre los que tenemos: Subcultivos Mantenimiento bajo capa de aceite. La liofilización La congelación mecánica (-20 ó -80º C) La ultracongelación en vapor de nitrógeno líquido (-156º C) o en nitrógeno líquido (- 196º C) El nitrógeno líquido es el más eficiente. Ing. Carlos Elías P.

14 1. Subcultivos Cuando ya se tiene el cultivo puro entonces se deben realizar subcultivos de las cepas. Es un método común de conservación y que consiste en el repique periódico del cultivo en un medio nutritivo fresco. Se debe considerar el medio adecuado para cada especie. Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4° C durante lapsos que oscilan entre 15 días y 2 meses. Ing. Carlos Elías P.

15 2. Mantenimiento bajo capa de aceite
Consiste en cubrir el cultivo después de su desarrollo en medio sólido, con una capa de aceite mineral o vaselina estéril. Los cultivos en esta forma se pueden conservar a temperatura ambiente. Las desventajas de esta técnica consisten en: Los microorganismos pueden continuar reproduciéndose, con posibilidades de aparición de mutantes. Sin embargo, estas alteraciones no se observan hasta los tres años de mantenimiento. Ing. Carlos Elías P.

16 3. Liofilización Consiste en congelar rápidamente una suspensión de microorganismos para posteriormente sublimarla sin pasar por el estado líquido. Luego se conservan entre 0 y 5° C durante muchos años. Para su recuperación se resuspenden en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada. Ing. Carlos Elías P.

17 4. Congelamiento Esta técnica se basa en una disminución drástica de temperatura que disminuye o anula el metabolismo del microorganismo. Se utilizan agentes crioprotectores como glicerol (10%). Asimismo, se utilizan ampollas de plástico en nitrógeno líquido. Las desventajas de esta técnica consisten en: Velocidades de congelamiento y descongelamiento. Como criterio general, es el enfriamiento a 1° C min-1 (ya que una rápida congelación causa ruptura de membranas) hasta -20 °C y luego un rápido descenso. Ing. Carlos Elías P.

18 Métodos para determinar el número total de microorganismos en los alimentos
Ninguno de los métodos utilizados permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Existen cuatro los métodos básicos: Recuento en placa (SPC = Standard Plate Count o REP = recuento estándar en placas) para la determinación del número de células viables. Método del número más probable (MPN = Most probable number o NMP = número más probable) de gérmenes como cálculo estadístico del número de células viables. Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células viables con capacidad reductora. Recuento microscópico directo (RMD) tanto para células viables como para las no viables. Ing. Carlos Elías P.

19 Recuento en placa para la determinación del número de células viables
Es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias (U.F.C.) en un alimento. Los recuentos de microorganismos viables se basan: en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento (dilución) e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Para la dilución se suele utilizar agua de peptona tamponada. Ing. Carlos Elías P.

20 …Recuento en para la determinación del número de células viables
Por su parte, las diluciones se inoculan en placas vertidas de agar triptona glucosa extracto o agar cuenta estándar. Las placas se incuban en condiciones de aerobiosis, a 35 °C durante 24 a 48 horas. Se utiliza luego un contador de colonias Quebec. Ing. Carlos Elías P.

21 …Recuento en para la determinación del número de células viables
Contador de colonias tipo Quebec: permite la visualización de colonias bacterianas en un fondo oscuro, gracias al sistema de iluminación uniforme y brillante. Provisto de un contador digital electrónico. efectúa la cuenta de colonias en las mismas placas Petri cerradas (las cuales pueden ser centradas con exactitud en el cuadrante) Ing. Carlos Elías P.

22 2. Método del número más probable (MPN o NMP) o el de los tubos múltiples
La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa. Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales). Sino tan solo es una presunción, que habrá de confirmarse posteriormente. Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la ausencia de dicho grupo bacteriano. Ing. Carlos Elías P.

23 …Método del número más probable (MPN o NMP)
Prueba presuntiva y prueba confirmativa: La prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general para cualquier grupo de bacterias. La prueba confirmativa es específica. Ing. Carlos Elías P.

24 Recuento de coliformes en agua por el NMP
Ing. Carlos Elías P.

25 Introducción Ing. Carlos Elías P.

26 Agua/contaminación /salud pública
La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública. El agua puede servir como vehículo de microorganismos patógenos. Es decir, productores de enfermedades llamadas comúnmente "de origen hídrico" tales como Salmonelosis (Tifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc. Estos microorganismos son todos de origen entérico (de los intestinos o relacionado con ellos ). Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Ing. Carlos Elías P.

27 Intestino grueso/patógenos
Además, ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y Varios microorganismos similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus faecalis) y Clostridium perfringens Son habitantes normales del intestino grueso de hombres y animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales. Así pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de: Contaminación fecal y El camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las materias fecales. Ing. Carlos Elías P.

28 Simplicidad del análisis mediante la detección de micoorganismos indicadores
La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como Salmonella spp. y Shigella spp. puede ser difícil de realizar. Ya que el número de estas bacterias es relativamente escaso. Por lo que se tiene que recurrir a pruebas de microorganismos indicadores: Que siempre estén presentes en materia fecal, Fácil de demostrar y Que sirva de guía para conocer el grado de contaminación fecal. Ing. Carlos Elías P.

29 Indicador de contaminación fecal
Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal“. El cual será utilizado para la valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo anterior, se ha adoptado con carácter general, el "Grupo Coliforme" como indicador más digno de confianza. La OMS incluye dentro del grupo coliforme todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram negativos, no esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la lactosa, a 35 – 37 °C. Ing. Carlos Elías P.

30 Especies clásicas de coliformes
Las especies clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El microorganismo indicador más comúnmente utilizado es Escherichia coli, La OMS considera preferible emplear la expresión "Coliforme fecal" que comprende: Un número ligeramente mayor de variedades, Todas ellas de claro origen fecal e Indicadores de contaminación fecal reciente. Ing. Carlos Elías P.

31 Definición de coliformes fecales
Para los efectos del análisis sanitario del agua, se define el Coliforme fecal como: Un bacilo aerobio o anaerobio facultativo. Gram negativo. No esporulado. Que fermenta la lactosa Con producción de ácido y gas a 44 °C (±0.5 °C) en menos de 24 horas. Ing. Carlos Elías P.

32 ¿En qué se basa el método?
El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra sin diluir. Pueden ser volúmenes de: 50, 10 y 1 mL, ó de 10, 1 y 0.1 mL, o diluida en caso necesario, en una serie de tubos por triplicado o quintuplicado con un medio que contiene lactosa (caldo lactosado o caldo lauril triptosa). Ing. Carlos Elías P.

33 Valoración del método del NMP/uso de tablas
La valoración del contenido microbiano de una muestra de agua por el método del NMP supone la utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua y las cantidades de tubos sembrados en una ó más series. Ing. Carlos Elías P.

34 En el fondo es un tratamiento estadístico/probabilistico
Realmente consiste en: Tratar estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada Que resulten positivos después de su incubación. Ing. Carlos Elías P.

35 No existe un método único que permita identificar todos estos m.o.
En cuanto a la investigación de patógenos en agua: No existe un método único. Que permita aislar e identificar todos estos microorganismos. En general, los métodos con los que se obtienen mejores resultados comprenden: Una fase de concentración. Seguida de técnicas de enriquecimiento y aislamiento específicas para cada microorganismo. Ing. Carlos Elías P.

36 Muestreo de agua Las muestras para el análisis bacteriológico, se deben tomar en frascos muestreadores que se hayan: Lavado y Esterilizado En su interior añadir, previo a la esterilización: 0.1 mL de solución de Na2S2O3 (tiosulfato de sodio) al 10%, por cada 120 mL de muestra. Con el propósito de neutralizar la acción del cloro que pudiera contener la muestra. Cubriendo además el tapón del frasco hasta el cuello con papel aluminio. Ing. Carlos Elías P.

37 Tiempo para realizar el análisis
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después de su recolección. De no ser así, se recomienda se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra. En ningún caso, este lapso debe de exceder de 24 horas para agua potable y De 6 horas para otros tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis. Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la muestra a 4 °C. Ing. Carlos Elías P.

38 Ing. Carlos Elías P.

39 Pruebas confirmatorias
Ing. Carlos Elías P.

40 Ing. Carlos Elías P.

41 Ing. Carlos Elías P.

42 Cálculos Se expondrá los cálculos Con dilución y Sin dilución
Ing. Carlos Elías P.

43 a. Cálculos sin dilución
La lectura de los resultados obtenidos en el análisis de agua de un grifo es la Sgte.: Volumen de muestra inoculada (ml) Tubos positivos en la prueba presuntiva de coliformes totales y fecales Tubos positivos de la prueba confirmatoria coliformes totales Tubos positivos de la prueba confirmatoria coliformes fecales 10 5 4 2 1 3 0.1 Ing. Carlos Elías P.

44 Lectura en la tabla para reportar
Reporte Coliformes totales 4,2,1 26 NMP de coliformes totales 26/100 ml Coliformes fecales 2,1,0 6.8 ˜ 7 NMP de coliformes fecales 7/100 ml Ing. Carlos Elías P.

45 Ing. Carlos Elías P.

46 b. Cálculos con dilución
Volumen de muestra inoculada (ml) Tubos positivos en la prueba presuntiva de coliformes totales y fecales Tubos positivos de la prueba confirmatoria coliformes totales Tubos positivos de la prueba confirmatoria coliformes fecales 0.1 4 3 2 0.01 1 0.001 Ing. Carlos Elías P.

47 Lectura en la tabla para reportar
Reporte Coliformes totales 3,1,1 14 NMP de coliformes totales 14/0.01=14x100=1400 NMP de coliformes totales = 1400/100 ml Coliformes fecales 2,1,0 6.8 ˜ 7 NMP de coliformes fecales 7/0.01 = 7x100 = 700 NMP de coliformes fecales = 700/100 ml Ing. Carlos Elías P.

48 Ing. Carlos Elías P.