Electroforesis de proteínas.

Presentación del tema: "Electroforesis de proteínas."— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis de proteínas.
Universidad de la sierra Juárez. Técnicas instrumentales. Profesor: M.C. Arturo Félix Díaz. Alumno: José Carlos mateo Santiago Lic. En biología, grupo 504, 5to semestre.

2 Electroforesis. Definición.
Es un método de separación basado en la movilidad de las biomoléculas en una fase líquida sometida a un campo eléctrico. Las moléculas que posean carga negativa migrarán hacia el polo positivo de un aparato electroforético y viceversa. La inclusión de una matriz sólida, permitió agregar un nuevo punto de separación y versatilidad en la electroforesis. (Smithies, 1955 )

3 Fundamento. La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E). Inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) (talla y forma de la molécula), o sea, a la resistencia que le ofrece el medio. V = q E / f

4 Componentes. Contenedor: evita la contaminación y derramamiento de las biomoléculas. Dos polos: negativo(-) y positivo(+), atraerán a las biomoléculas. Fuente de poder: genera un campo eléctrico regulable. Matriz: permite un segundo punto de resolución. Solución amortiguadora de pH: mantiene la integridad de las biomoléculas. (Brody y Kern, 2004).

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6 Electroforesis de proteínas.
Las proteínas son biomoléculas cuyos monómeros son aminoácidos polimerizados por medio de enlaces peptídicos. A diferencia de los ácidos nucleicos, que poseen una carga neta negativa, la carga de las proteínas es muy variable porque en ellas puede haber aminoácidos tanto negativos como positivos (Zwitterión). Necesita un gradiente de pH que las atrape en su punto isoeléctrico (punto donde la proteína tendrá una carga neta de cero y no se podrá mover más en un campo eléctrico). (Tiselius, 1937)

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8 Tipos de electroforesis.
Electroforesis de zona. Isoelectroenfoque. Separación por tamaño.

9 Electroforesis de zona.
Las proteínas son moléculas anfóteras. Medio de soporte: papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar. La muestra cuyas proteínas se quieren separar se inserta en un medio de soporte y se aplica una diferencia de potencial durante un tiempo determinado para separar las proteínas. Cada proteína migrará más o menos en función de su carga y su tamaño. A mayor carga y menor tamaño, más velocidad de migración.

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11 Isoelectroenfoque. En lugar de separar las proteínas en función de su carga a un pH dado, se separan en función de su punto isoeléctrico (pI). El pI es el pH en el que la carga neta de la proteína es nula. Depende de la composición aminoacídica de la proteína. Se crea un gradiente de pH mediante anfolitos (estabilizan el pH a lo largo del gel). Cada proteína migrará hasta alcanzar su pI, punto en el cual precipitará al acumularse (de ahí el nombre, isoelectroenfoque).

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13 Separación por tamaño. Las proteínas, deben ser tratadas con SDS (sodio dodecil sulfato) para que su carga sea negativa y todas migren hacia el ánodo. La separación se hace en medios de soporte en el que se ha creado un tamiz molecular (matriz), que hace que las proteínas más pequeñas “corran” más que las más grandes.

14 Pasos.

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16 Preparación de geles de poliacrilamida.
El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida. Al no estar las cadenas unidas entre sí, formarían un gel sin consistencia mecánica y totalmente inmanejable. Para evitar esto, se utiliza otro monómero, la N,N’-metilen-bisacrilamida que forma parte de dos cadenas que quedan así unidas covalentemente.

17 Normalmente, el proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disolución acuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida) Posteriormente se adiciona TEMED (N,N,N’,N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción de polimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización). Por lo tanto, ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de polimerización.

18 La temperatura óptima de polimerización es de 25-30°C y el proceso ocurre en pocos minutos, aunque conviene dejarlo transcurrir más tiempo para que no queden restos de monómeros o de pequeñas cadenas libres.

19 Laemmli (1970) implementó un tratamiento para poder separar a las proteínas con base en su peso molecular. Este consiste en la homogenización de la carga con dodecilsulfato de sodio (SDS). Desnaturaliza a las proteínas y las cubre de una carga neta negativa para que migren hacia el polo positivo durante la electroforesis (SDS, DTT). SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

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21 Electroforesis de 1D. Es útil para las aplicaciones rutinarias como el seguimiento de los niveles de acumulación de proteínas, así como para su purificación, separación, hibridación con anticuerpos y análisis de peso molecular. Electroforesis de 2D. Consiste en someter a las proteínas al campo eléctrico en presencia de un gradiente de pH (usualmente 2-11) que enfocará a las proteínas en su punto isoeléctrico.

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24 Electroforesis de 2D. Realizar una electroforesis 1D para separar por peso molecular, posteriormente tratar al gel con SDS (Garfin, 2003), para después nuevamente aplicar carga eléctrica. El método 2D puede separar a prácticamente todas las proteínas presentes en una condición biológica, mismas que pueden ser secuenciadas e identificadas mediante espectrometría de masas (MS). Cuando la electroforesis 2D se combinó con el método analítico de espectrometría de masas (MS), se fundó una nueva rama del estudio masivo de las proteínas que se conoce como proteómica (Yates, 2011). Ambos tipos de electroforesis de proteínas son visualizados con tinciones como la de azul de Coomassie o con plata (Sambrook et al., 2001).

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27 Transferencia a membranas (Western Blot).
Finalizada la PAGE, se puede obtener información acerca de las proteínas si éstas se transfieren desde el gel a una membrana. Transferencia (Blotting). Descrita por E. M. Southern para el caso de DNA (Southern Blot); posteriormente y continuando con la misma terminología, se describió para el caso de RNA y proteínas (Northern y Western Blot respectivamente). En la membrana, las proteínas están accesibles para interaccionar con otras moléculas que permitan su identificación: anticuerpos (inmunoblotting), lecitinas, ácidos nucleicos, receptores o cualquier otro ligando.

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29 Western Blot. Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular. A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés. El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra .

30 ¿Porqué se utilizan anticuerpos?
¿Cuál de las bandas corresponde a la proteína de interés? El uso de anticuerpos específicos soluciona el problema detectando únicamente la proteína de interés.

31 Bloqueo. El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incubando con una solución diseñada para reducir los lugares de unión no específicos al anticuerpo. A menudo, son soluciones a base de proteínas, como la leche descremada en polvo o la albúmina de suero bovino (BSA).

32 Tinción de proteínas en el filtro
Habitualmente se emplean técnicas de tinción de proteínas sobre el filtro como control de la transferencia. Existen diferentes métodos para teñir todas las proteínas presentes en el filtro, pero los que más interés despiertan son los métodos de tinción de proteínas específicas a partir de mezclas complejas separadas en geles y transferidos a filtros, son los métodos de tinción específicos, usualmente basados en métodos inmunoquímicos.

33 Colorantes. Los colorantes que permiten teñir las proteínas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en los filtros pues se unen inespecíficamente a éstos. Para teñir las proteínas en los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro amido.

34 Aplicaciones. Determinación de la masa molecular
Detectar la presencia de una proteína en un homogeneizado o extracto de un tejido.  Detectar la presencia de anticuerpos circulantes. Medicina. Análisis de virus VIH. Laboratorios.

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