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PRESENTA EQUIPO 5. ¿Qué es la electroforesis? Técnica de separación que se basa en la diferente movilidad o velocidad de migración de partículas cargadas.

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1 PRESENTA EQUIPO 5

2 ¿Qué es la electroforesis? Técnica de separación que se basa en la diferente movilidad o velocidad de migración de partículas cargadas debido a la acción de un campo eléctrico

3 SEPARACIÓN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA Separa los diferentes elementos que componen una mezcla compleja en función de la carga eléctrica de los mismos VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS Depende de... La carga de las mismas La intensidad del campo eléctrico y Del coeficiente de fricción de las moléculas con el medio

4 APLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS Fraccionamiento de las hemoglobinas Diferenciación de la hemoglobina fetal Diagnóstico de talasemias, anemias falciformes, etc Proteínas séricas Proteínas urinarias Lipoproteínas Ácidos nucleicos Enzimas Inmunoelectroforesis Etc.

5 fundamento Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).

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7 El movimiento de las moléculas esta gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado las moléculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusión.

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9 La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo. Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma común de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también.

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12 electro migración Mucha gente cree que la electro migración es la "migración de electrones" pero en realidad es el material que "migra" por causa de un flujo de electrones, por eso se llama electro-migración La electro migración es un fenómeno que depende de la temperatura

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17 Tipos de electroforesis Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo habitualmente en dos modalidades que difieren notablemente: electroforesis convencional y electroforesis capilar. La primera es la metodología clásica que ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico. Las separaciones convencionales se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel poroso que contiene un tampon acuoso en el interior de sus poros. Normalmente, esta placa tiene unas dimensiones de unos pocos centímetros de lado, y al igual que las placas de cromatografíca en capa fina, es capaz de separar varias muestras simultáneamente. Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la placa, y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la placa, durante un período de tiempo fijo. Cuando se juzga que las separaciones se han completado, se interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se detienen para visualizarse de modo similar La electroforesis convencional es, actualmente, la técnica de separacion más ampliamente utilizada por biólogos y bioquímicos.

18 FUNDAMENTO DE LAS SEPARACIONES ELECTROFORETICAS La velocidad de migración de un ion, v, en centímetros por segundo, en el seno de un campo eléctrico, es igual al producto de la intensidad del campo eléctrico E (V cm -1 ) por la movilidad electroforética µ e (cm 2 V -1 s -1 ), esto es: v = µ e E La movilidad electroforética es directamente proporcional a la carga eléctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. El campo eléctrico actúa solamente sobre los iones. Si dos especies difieren bien en la carga o en las fuerzas de rozamiento, se moverán a través del tampón y se separan. Las especies neutras no se separan

19 ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad; sin embargo este tipo de separación electroforética es lenta, laboriosa y difícil de automatizar, y además no proporciona resultados cuantitativos precisos. La investigación y la aplicación de la electroforesis llevada a cabo en capilares tuvo un crecimiento explosivo durante la segunda mitad de la década de los ochenta, ello unido a la aparición de varios instrumentos comerciales. La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0,1 a 10 nL, en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volúmenes de muestra del orden de µL) y con una elevada resolución y rapidez. Además, las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar

20 VELOCIDADES DE MIGRACION Y ALTURAS DE PLATO EN ELECTROFORESIS CAPILAR Esta relacion indica que es necesario que se apliquen potenciales elevados para obtener migraciones ionicas rápidas y una rápida separacion. Si bien es deseable que las separaciones sean rápidas, es aún más importante obtener separaciones de alta resolucion. Por ello, se hace necesario examinar los factores que determinan la resolucion en la electroforesis.

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22 INTRODUCCION DE LA MUESTRA En el método de inyección electrocinética, se retiran del deposito del tampón uno de los extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un pequeño recipiente donde está situada la muestra. Se aplica entonces un potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos de migración iónica y flujo electro osmótico. El extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolución tampón, donde se mantienen durante el resto del proceso de separación. Esta técnica de inyección es discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones más móviles respecto a los más lentos. En el método de inyección por presión, el extremo del capilar se coloca momentáneamente en un pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presión para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacío en el extremo del detector o de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevación del extremo que contiene la muestra. La inyección por presión no diferencia los iones según su movilidad; sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel.

23 Fundamento de la detección Limite de deteccion (moles detectados) Espectrometría Absorción Fluorescencia Derivatizacion pre columna Derivatizacion en columna 8 x Derivatizacion pos columna 2 x Fluorescencia indirecta5 x Lentes térmicas4 x Raman c 2 x Espectrometría de masas 1 x Electroquímica Conductividad c 1 x PotenciometriaNo Amperometria7 x Radiometria c 1 x modalidades de detección en electroforesis capilar'

24 APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo de distintas maneras, también llamadas modalidades. Es interesante destacar que estas modalidades se emplearon en primer lugar en la electroforesis convencional, y se adaptaron posteriormente a la electroforesis capilar. Estas modalidades son la electroforesis capilar de zona (CZE), electroforesis capilar en gel (CGE), isoelectroenfoque capilar (CIEF) e isotacoforesis capilar (CITP).

25 Métodos electroforéticos zonales. Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente. Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este método tiene gran poder resolutivo por que se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple, fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos electrodos

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27 Electroforesis en gel de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

28 Se utiliza para la separación de especies anfóteras como aminoácidos y proteínas que presentan en su estructura un grupo carboxílico y un grupo amino

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