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ELECTROFORESIS La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico Se puede controlar.

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Presentación del tema: "ELECTROFORESIS La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico Se puede controlar."— Transcripción de la presentación:

1 ELECTROFORESIS La electroforesis esta basada en la movilidad de las moléculas cuando se encuentran bajo el efecto de un campo eléctrico Se puede controlar el tamaño del poro efecto de tamiz molecular Puede llevarse a cabo en: Solución Superficie hidratada de un soporte sólido (papel o acetato de celulosa) Matriz porosa (en gel de poliacrilamida o agarosa)

2 A su vez, q = carga E = intensidad del campo Si se asume que la partícula es esférica, a partir de la Ley de Stokes se obtiene que, R = radio de la esfera v = velocidad η = viscosidad del fluido Reordenando

3 La movilidad electroforética (μ) es una magnitud característica de la partícula o molécula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que: La movilidad electroforética depende de la carga y del tamaño de la partícula

4 Factores que afectan la electroforesis La electroforesis depende del campo eléctrico y este depende de distintos parámetros: Ley de Ohm V = diferencia de potencial R = resistencia I = intensidad define el campo eléctrico, la velocidad de avance es directamente proporcional a ella la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con la distancia recorrida por las moléculas Temperatura es necesario controlar el aumento de temperatura debido al Efecto Joule

5 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Electroforesis nativa ¿Las proteínas tienen carga? Excepto en el pI, a cualquier pH las proteínas tienen carga neta ¿Cuál es la concentración de acrilamida óptima para separar una mezcla de proteínas? Depende de la carga y tamaño de la proteína

6 Gráfico de Ferguson R f = distancia que migró la proteína distancia que migró la referencia Kr = coeficiente de retardo se relaciona con el tamaño molecular %T logR f

7 Determinación del peso molecular mediante gráficos de Ferguson Se determina el Kr de proteínas estándar de peso molecular conocido y se realiza una curva de calibración Se determina el Kr de la proteína problema y se interpola en la curva obteniéndose el peso molecular Inconveniente: Las proteínas usadas para la curva de calibración deben tener la misma forma, grado de hidratación y volumen específico que la proteína nativa

8 Electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) Dodecil sulfato de sodio (SDS) Desnaturaliza las proteínas Confiere cargas negativas uniéndose en proporción al tamaño de la proteína (una molécula de SDS por cada dos aminoácidos, ~1.4 g SDS/g proteína) Polipéptidos distintos tienen la misma densidad de carga migran solo según su peso molecular

9 distancia que migró la proteína distancia que migró el colorante X X X X X logPM RfRf R f = distancia que migró la proteína distancia que migró el colorante de referencia

10 Dos consideraciones importantes 1. Para una concentración de gel dada, la relación lineal entre el logPM y el R f es lineal solo en un rango limitado de pesos moleculares 15 % acrilamida: – Da 10 % acrilamida: – Da 5 % acrilamida: – Da

11 2. En esta electroforesis la proteína está desnaturalizada, por lo tanto, el peso molecular que se obtiene puede no ser el de la proteína nativa Proteínas con estructura cuaternaria (formadas por más de una subunidad) ¿ y si las subunidades están unidas por puentes disulfuro? Agregamos un reductor como el 2-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT)

12 + 2-mercaptoetanol a d c b - 2-mercaptoetanol a d c b PM (proteína nativa) Proteína a: 34 KDa Proteína b: 140 KDa Proteína c: 64 KDa Proteína d: 32 KDa

13 Isoelectroenfoque Se lleva a cabo en un gradiente de pH que se establece entre dos electrodos El gradiente de estabiliza utilizando anfolitos Las proteínas migran hasta alcanzar un pH igual a su punto isoeléctrico cátodo ánodo Es muy útil para estudiar modificaciones postraduccionales en proteínas, trabajar con isoenzimas, etc

14 Electroforesis en dos dimensiones Primera dimensión: isoelectroenfoque Segunda dimensión : SDS-PAGE Permite analizar mezclas más complejas como extractos celulares, muestras de sangre, etc

15 Electroforesis capilar Aumenta la relación superficie-volumen: permite un mejor control de la temperatura y por lo tanto la posibilidad de aplicar voltajes mayores Las muestras pueden correr en solución o en gel Se siembran volúmenes pequeños de muestra, pero ésta debe estar concentrada La detección implica observar las bandas de proteína a medida que estas pasan por una sección de capilar (detección UV, fluorescente, espectrometría de masa) Solo se puede analizar una muestra a la vez, pero es una técnica rápida, no implica tinción y los datos obtenidos son cuantitativos

16 Visualización de las bandas en el gel 1. Tinción Azul de Coomassie: se une a las proteínas en forma específica (~0.1 µg de proteína) es necesario un paso de desteñido Plata: 100 veces más sensible que la tinción con Coomassie Es necesario en primer lugar fijar las proteínas al gel para minimizar la difusión Se expone al gel a una solución de nitrato de plata y éste es reducido a plata metálica donde se encuentran las proteínas produciendo la precipitación de granos de plata Puede presentar importantes backgrounds, es más cara e implica más pasos

17 Azul de Coomassie Plata

18 2. Detección de proteínas específicas a. Medida de actividad Restringida a enzimas y geles nativos Purificación de xantina oxidasa a partir de crema de leche xantina + 2O 2 ácido úrico + 2O H + xantina oxidasa NBT oxidado Formazán insoluble

19 b. Reacción con anticuerpos específicos (Western blot) Se transfieren las proteínas desde el gel hacia una membrana (nitrocelulosa o polifluoruro de vinildeno PVDF) La membrana se pone con contacto con una solución de anticuerpos específicos para alguna proteína o modificación proteica Se detecta la unión antígeno-anticuerpo por fluorescencia, actividad enzimática, etc Ac-AntiSO 2/3 H Ac-AntiNO 2 Y Randall et al.

20 3. Otros Autorradiografía Si el material a analizar es radiactivo, el gel se pone en contacto con un film fotográfico También puede visualizarse en forma directa con el equipamiento adecuado Sondas fluorescentes Se pre-tiñen las proteínas con una sonda fluorescente Gran sensibilidad Puede ocasionar cambios en la migración en el gel pues reaccionan con grupos amino Para observar las bandas se expone el gel a luz UV

21 Detección de glicoproteínas Se detectan en forma específica usando reactivos que reaccionan con los polisacáridos (dansil hidrazina) Detección de fosfoproteínas Marcado (in vivo) con 32 P, revelado por autorradiografía Liberación del grupo fosfato y atrapado en el gel de fosfato de calcio (derivado insoluble)

22 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADN, ARN) Presenta carga negativa debido a los grupos pirofosfato, por lo que el número de cargas negativas es proporcional al tamaño de la molécula Si se encuentran en conformación lineal migrarán según su tamaño Generalmente se utilizan geles de agarosa Su capacidad de resolución depende del porcentaje de agarosa 0.7 % (5 – 10 kb) 2% (0.2 – 1 kb)

23 Para moléculas pequeñas: agarosa 3% o poliacrilamida Para moléculas muy grandes: electroforesis de campo pulsado. Permite analizar moléculas de ADN de hasta Kpb (cromosoma de levadura)

24 Visualización de las bandas 1. Moléculas fluorescentes e intercalantes: bromuro de etidio ¡¡Como agente intercalante puede ser carcinogénico, mutagénico y teratogénico!! Otras alternativas: SYBR Green, Goldview (agentes intercalantes)

25 2. Southern (ADN) y Northern (ARN) blot Requiere transferir desde el gel hacia una membrana Se hibrida con una sonda marcada capaz de hibridizar con una secuencia de interés


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