Diagnóstico SIFILIS.

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1 Diagnóstico SIFILIS

2 Diagnóstico de Sífilis
Generalidades: Sífilis, es una enfermedad infecciosa conocida desde el siglo XV. , se descubrió en 1905 en una lesión sifilítica secundaria. Agente causal bacteria :Treponema pallidum (Trepo:giro; nema: hebra; hebra que gira)

3 Diagnóstico de Sífilis
Espiroqueta delgada, enroscada, de 6 a 12um de longitud y 0,25um de diámetro. Móvil , No se colorea (pallidum: pálido) ausencia de tinción con colorantes convencionales. Observable por microscopía de campo oscuro o mediante tinción con Ac específicos antitreponema marcados con colorantes fluorescentes. Estas espiroquetas son incapaces de desarrollarse en cultivos acelulares.

4 DIAGNOSTICO SIFILIS DIRECTOS: (Ag)
CAMPO OSCURO Fluorescencia Directa (DFA-TP) - NO HACEMOS INDIRECTOS: Pruebas serológicas: (Ac) Pruebas no treponémicas: Pruebas treponémicas

5 Diagnóstico de Sífilis
Examen Directo: Microscopía de campo oscuro Exudado de la lesión «chancro» Inmediatez y bajo costo Gran rendimiento en etapas en que hayan lesiones : primaria, secundaria, congénita precoz y recaída infecciosa.

6 CAMPO OSCURO Requerimientos de personal muy capacitado.
Inespecificidad ante espiroquetas saprófitos presentes en muestras de mucosa bucal, anal y genital. Tomar muestra del chancro, con ansa estéril, poner en un porta , ver microscopia de campo oscuro el movimiento característico, …..en el momento. No realizar en muestras orales o rectales.

7 CAMPO OSCURO Criterio de informe
Observación en campo oscuro: Negativa o Positiva. La imposibilidad de encontrar bacteria : NO excluye DX. Este es el método Directo más utilizado. Debemos derivar al paciente. ¿ DONDE? A LABORATORIOS DE REFERENCIA Lugar: HOSPITAL San Bernardo- Lab. Inmunoserologia Referencia adultos. Hospital Señor Del Milagro- Lab. Inmunoserologia. Referencia adultos.

8 DIAGNOSTICO SEROLOGICO
Investigo Anticuerpos. Técnicas no treponémicas: VDRL ( USR) :Venereal Disease Research Laboratory Técnicas Treponémicas: Microhemaglutinación para anticuerpos de T.pallidum ( MHA-TP). Aglutinación de partículas para la detección de anticuerpos contra T.pallidum ( TP-PA ) . Absorción de Anticuerpos treponémicos fluorescentes ( FTA abs ).

9 Técnicas no treponémicas: VDRL
El antígeno es una solución alcohólica incolora que contiene cardiolipina, colesterol y lecitina purificada , para producir una reactividad estándar. Detectan anticuerpos tipo IgG e IgM anti material lipídico liberado por células del huésped dañadas y material lipoproteico de la bacteria.

10 PRUEBA DE VDRL La metodología que usa es la Floculación en placa o tarjeta. Económicas y fáciles de realizar. Nivel aceptable de especificidad y sensibilidad alta. Muestras: suero , plasma heparinizado o LCR. Permite análisis cualitativo y cuantitativo

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12 VDRL VDRL: INESPECIFICA para Sífilis.
Al ser Ag de VDRL : Una mezcla de sustancias que se encuentran en la pared del treponema , agente causal de Sífilis, pero también en muchas células del organismo. VDRL (+): Detecta Ac anti fosfolipidos.

13 VDRL : Prueba No treponemica
Detecta los Ac como reaginas, son Ac heterofilos, es decir, NO específicos contra Treponema. Estos Ac , reaccionan con Antígenos Lipídicos , tienen capacidad de Flocular con Ag. lecitina –colesterol y cardiolipinas.

14 VDRL: Técnica de Floculación
Fundamento de VDRL. Método de floculación en placa . Es muy sensible, es una prueba es basada en la reacción de floculación visible del antígeno artificial. Los Anticuerpos IgG del suero del paciente, (Reaginas) reaccionan con complejo lipoide con cardiolipina, produciendo una reacción de floculación visible en el microscopio.

15 Método de Floculacion Mecanismo de Interacción Secundaria , que evidencia unión Ag-Ac in vitro. Esta Interacción tiene dos etapas: Primaria : no visualizable. Secundaria : Aparece fenómeno visible ( Floculación). Los complejos Ag-Ac se agregan y sedimentan en un rango muy estrecho de su relación . Zonas de exceso de Ag o de Ac , solo forman complejos solubles, dando (-) prueba.

16 Cinética de floculación
Responsable del fenómeno de PROZONA. Ac (+) (-) (-) Mucho Ac – poco Ag Equimolecular Exceso de Ag -Poco Ac Ausencia Floculos FLOCULOS Ausencia de Floculos Ag = Ac Ag

17 PROZONA Mucho Ac Ac = Ag Mucho Ag “ PROZONA” “ PROZONA”

18 Técnicas no treponémicas VDRL Venereal Disease Research Laboratory
Reactivo de VDRL ( Ag no específicos del Treponema ). Rotador: 180+/- 2 rpm. Pipetas automáticas de ul Temperatura ambiente de 23º a 29ºC Materiales: Láminas de vidrio 2x3 pulgadas con 6, 12 ,24 anillos de parafina o cerámica de 14 mm de diámetro.

19 Materiales : VDRL

20 Técnicas no treponémicas- VDRL
Económica Requiere de personal muy capacitado en la lectura de los resultados. Lectura macroscópica y microscopica. Puede presentar fenómeno de prozona

21 Técnica de VDRL Cada vez que realizo la prueba, largo sueros controles. La muestra : suero, plasma heparinizado, debe ser limpia. Se debe examinar los sueros/plasmas y centrifugar nuevamente los que presenten partículas, hematíes, fibrina o turbidez. Los sueros deben estar a temperatura ambiente (23 a 29º C). Con un palillo plástico o de madera extienda el suero, su dilución en la superficie de la placa de vidrio demarcada por el anillo, junto Reactivo añadido.

22 VDRL: Técnica en placa Evitar fenómeno de Prozona en toda muestra. OBLIGATORIO: Cada muestra se larga forma directa y diluida en placa 1/ 10 . Por cada muestra coloque con una micropipeta coloque 50 µl de suero dentro de un círculo de la lámina de vidrio y en otro círculo, 45 ul de sol. Fisiológica mas 5 ul de suero ( Dilucion1/10), para evitar la prozona. Agite el antígeno y adicione una gota de este sobre cada uno de los sueros con el gotero dispensador. Rote las láminas durante 4 minutos en un agitador mecánico a 180 ± 2 rpm. El punto final se lee en MICROSCOPIO y objetivo 10x.

23 Técnica de VDRL Si directo flocula : (+) titular
Suero directo: 50 ul SUERO gota Reactivo VDRL: Suero diluido 1/ 10 : 45 ul SF + 5ul suero gota Reactivo VDRL: Si directo flocula : (+) titular Si ambos floculan: (+)titular a diluciones mayores ½, ¼ , etc… Si solo flocula el diluido: (+) estamos en PROZONA: exceso de Ac : TITULAR

24 VDRL Si da (+) cualquiera de los dos pocillos , se debe titular
Titulo: es el máximo punto de reacción que flocula. La titulación se realiza en placa: Titular NO es confirmar. La confirmación requiere otro tipo de Técnicas, con Ag Propios del Treponema .

25 VDRL INFORME: Reactivo Reactivo Débil No Reactivo
• Toda prueba con resultado Reactivo o Reactivo Débil en la fase cualitativa debe titularse para informarse cuantitativamente.

26 TILULACION de VDRL Realizar la prueba cuantitativa a todos los sueros reactivos, reactivos débiles. Se realizaran las diluciones en placa: (1:1 suero sin diluir), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 y así sucesivamente. TECNICA: Coloque 50 µl solución salina 0,9 % en cada uno de los pocillos utilizados para titular a partir del 1: …….. 50 ul S.F ul S.F ul S.F. 50 µl de suero ul de suero ul dil 1/ ul dil 1/4 1 dils ½: 2 Dils ¼: 4Dils /8: 8 Dils ul Rvo (Ag) el Rvo (Ag) ul Rvo (Ag) el Rvo (Ag). Hacer dilución en cascada, para obtener las diluciones 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, etc. Rotar la lámina de vidrio durante 4 minutos en agitador mecánico a 180 ± 2 rpm. Leer las pruebas inmediatamente después de la rotación con el microscopio y objetivo 10x.

27 Titulacion de VDRL

28 Titulo de VDRL: Reportar hasta el último titulo de la dilución en que se observó claramente la floculación como se observa en la siguiente tabla PRUEBA CUANTITATIVA - Diluciones Títulos 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 AUSENCIA GRUMOS c/ SUERO PURO NO REACTIVA SUERO SIN DILUIR : REACTIVO RD N 1 Dils REACTIVO R 2 Dils 4 Dils 8 Dils

29 VDRL en LCR La prueba del VDRL es la única recomendada para LCR (detectar neurosífilis). Diluir Antígeno : Adicionar una parte de solución salina al 10% a una parte de la suspensión de antígeno VDRL.(Diluir Ag1/ 2). La sensibilidad antígeno VDRL para LCR es buena solamente por dos horas después de su preparación. Procedimiento : Prueba cualitativa . La muestra debe estar a temperatura ambiente (23 a 29º C).

30 Neurosifilis: LCR escasos Ac , debo tener poco Ag, para que flocule la prueba. Diluir Antígeno

31 VDRL en LCR Depositar 50 µl de LCR en una lamina plana con cavidades circulares.. Mezclar suavemente el antígeno. Agregue una gota de la suspensión de Antígeno Diluido 1/2 sobre la muestra de LCR. Rotar la lámina de vidrio durante 8 minutos en agitador mecánico a 180 ± 2 rpm. Leer las pruebas inmediatamente después de la rotación con el microscopio y objetivo 10x.

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33 CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS de VDRL
Agudas Inmunizaciones Neumonía viral Varicela Paludismo Sarampión Embarazo Herpes genital Mononucleosis Consumo de drogas por vía parenteral HIV Leptospirosis Borreliosis

34 CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS de VDRL
Crónicas Envejecimiento Trastornos autoinmunitarios Lupus eritematoso sistémico Lepra Artritis reumatoide Consumo de drogas por vía parenteral Neoplasias La manifestación de la falsa reactividad, puede ser títulos bajos: de 1:4 o 1:8. a moderados 1/ 16 o 1/32.

35 Sólo la prueba VDRL está validada para la detección de
VDRL: CONCLUSIONES Puesto que no miden anticuerpos específicos frente a T. pallidum su positividad no asegura enfermedad sifilítica. Una de las ventajas de estas técnicas: fundamental para monitorear la eficacia de los tratamientos mediante el descenso de los títulos séricos en el tiempo , hasta negativizarse. Sólo la prueba VDRL está validada para la detección de anticuerpos no- treponémicos en LCR y, en consecuencia, es el único útil para el diagnóstico de neurosífilis, (junto a una treponémica en suero).

36 Pruebas Treponemicas Microhemaglutinación para anticuerpos de T.pallidum ( MHA-TP). Aglutinación de partículas para la detección de anticuerpos contra T.pallidum ( TP-PA ) Absorción de Anticuerpos treponémicos fluorescentes ( FTA abs )

37 Pruebas Treponemicas : ¿Quiénes lo realizan?
Todos los Laboratorios de Referencia. Todos los Laboratorios de la Red . Todos los Laboratorios que cuenten con los Reactivos indicados. Deberán apoyar a los Laboratorios que no lo posean.

38 Pruebas Treponemicas Todas las pruebas treponémicas, específicas, son cualitativas y sólo se utilizan para confirmar la prueba no treponémica VDRL. Confirman el diagnóstico de Sífilis. Tienen alta sensibilidad y especificidad.

39 Técnicas treponémicas
Son técnicas que usan antígenos de membrana externa de Treponema pallidum y antígenos recombinantes. Detectan anticuerpos IgG e IgM anti Treponema pallidum. Son exámenes confirmatorios (FTA-Abs y MHA-Tp) Son muy sensibles y muy específicos Permanecen reactivos de por vida. Son exámenes cualitativos No sirven para monitoreo de terapia: Ac persisten elevados. No sirven para re-infección No estandarizados para diagnóstico de Neurosífilis.

40 Técnicas treponémicas : FTA-Abs
Es el método de referencia para la detección de anticuerpos. Muestra de suero inactivado a 56ºC en baño termorregulado por 30 minutos. Usa fracciones de Treponemas como antígeno. El conjugado consiste en Antiglobulina humana con isotiocianato de fluoresceína. Es una técnica compleja y de alto costo, se requiere equipamiento y personal adiestrado. Microscopio Inmunofluorescencia. Permanece positiva de por vida. Técnica operador dependiente.

41 Técnicas treponémicas FTA-Abs
Es útil en todas las etapas de la enfermedad Presenta alrededor de un 1% de falsos positivos. Está sometida a múltiples causas de error si no se estandarizan previamente todos los reactivos entre si. Lectura menos objetiva (fluorescencia inespecífica). Debe realizarse previa absorción del suero para eliminar la reacción cruzada con otros treponemas. (sorbente). La reactividad se declara en cruces por la intensidad de la fluorescencia.

42 Técnicas treponémicas : MHA-Tp
Utiliza glóbulos rojos de pollo como fase sólida, sensibilizados con proteínas de Treponema pallidum. Método de aglutinación. Es una técnica sencilla. No requiere de equipamiento complejo. Espejo lector y microplacas con fondo cóncavo. Tampoco esta homologada para su empleo en LCR. Produce menos falsos positivos que FTA-ABS.

43 Microhemaglutinación para anticuerpos de T.pallidum ( MHA-TP)
El antígeno son hematíes sensibilizados . La prueba se realiza en microplacas de fondo en U. Se utilizan hematíes no sensibilizados como control. Prueba Cualitativa :Para realizar la técnica, seguir las indicaciones del fabricante del equipo. Atemperar muestras y reactivos, temperatura ambiente controlada entre 23 y 29ºC .

44 Técnicas Treponémicas MHA-Tp

45 Técnicas treponémicas

46 Microhemaglutinación para anticuerpos de T.pallidum ( MHA-TP)
Muestra: Suero o plasma heparinizado. Libres de contaminación y no hemolizadas, Muestras frescas pueden ser mantenidas hasta por 48 horas a una temperatura de 2 a 8 ºC, o por 4 semanas a -20 grados ºC. Criterio de informe: Reactivo: capa celular lisa que cubre todo el fondo de la celda o un área menor de la misma. No reactivo: fondo compacto bien definido en el fondo de la celda.

47 Técnicas Treponémicas TP-PA
TP-PA: Aglutinación de partículas para la detección de anticuerpos contra T.pallidum . Utiliza como soporte partículas de gelatina sensibilizadas conT.pallidum patógeno ( cepa Nichols).

48 Técnicas Treponémicas TP-PA
El principio de la reacción se basa en que las partículas sensibilizadas son aglutinadas por la presencia de anticuerpos contra el T.pallidum en suero /plasma humano. Utiliza partículas no sensibilizadas como control. Preparar los reactivos y realizar la técnica de acuerdo a las indicaciones del fabricante del equipo.

49 Técnicas Treponémicas TP-PA
Muestra: Suero (no utilizar plasma), las muestras deben estar libres de contaminación y no hemolizadas. Las muestras frescas pueden ser mantenidas hasta por 48 horas a una temperatura de 2 a 8 grados C. o por 4 semanas a -20 grados C. PROCEDIMIENTO Cada Kit contiene un frasco de buffer diluyente, células No sensibilizadas control y células sensibilizadas de prueba, controles positivo y negativo listos para usar.

50 Técnicas Treponémicas TP-PA
Criterio de informe: No reactivo: partículas concentradas en forma de botón en el fondo de la celda. Reactivo: partículas extendidas cubriendo el fondo de la celda uniformemente o anillo grande definido con un margen externo desparejo y aglutinación periférica.

51 TP-PA : Aglutinación de partículas .

52 Técnicas treponémicas
Falsos positivos Mononucleosis Lepra Enfermedad de colágeno Borreliosis Leptospirosis HIV Anemia hemolítica autoinmune Adictos a drogas por vía parenteral

53 VDRL: UTILIDAD VDRL es la única prueba útil en el seguimiento serológico, mostrando la caída gradual del título . En la curación( disminución del título > o = a 4 veces , ( ej. de 32 a 8 dils) ; o un incremento frente a un tratamiento inadecuado; o una reinfección. Si la VDRL en pacientes con Sífilis, aumenta 4 veces el título ( 4dils a 16 dils) en muestras seriadas, sugiere una infección, una reinfección o un tratamiento inadecuado ( falla en el tratamiento). Una disminución de 4 veces el título ( 64 dils a 16 dils) después del tratamiento para Sífilis temprana ( estadío primario o secundario) sugiere que el tratamiento fue adecuado.

54 Pruebas Treponémicas: UTILIDAD
TODAS Pruebas Treponémicas son Cualitativas. Confirman una VDRL, o Sífilis. Las pruebas treponémicas, MHA-TP o TP-PA y la FTA abs permanecen reactivas por muchos años, no son adecuadas para seguimiento serológico.

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60 ¡¡¡¡¡¡MUCHAS GRACIAS !!!!!