Comparación de métodos

Presentación del tema: "Comparación de métodos"— Transcripción de la presentación:

1 Comparación de métodos
Determinación de proteínas A. Ley de Lamber y Beer B. Curva patrón C. Método UV: Abs 280nm D. Métodos colorimétricos: Biuret, Lowry, bradford, BCA. Comparación de métodos

2 Cuantificación de Proteínas
Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos.

3 Cuantificación de Proteínas
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, o la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.

4 Ley de Lambert - Beer Relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

5 A = ε·c·l LEY DE LAMBERT Y BEER
La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y A, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. A = ε·c·l Donde: A = absorbencia  = Coeficiente de extinción molar. l = longitud de la celda.

6 COEFICIENTE DE EXTINCIÓN MOLAR
Es una medida de la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración. Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extinción molar es muy eficiente en la absorción de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorción cuando se encuentra en disolución a concentraciones muy BAJAS.

7 Métodos para determinar proteínas
Intervalo del UV Todas la proteínas pueden ser detectadas, sin embargo solo ciertos residuos de aminoácidos son los que se leen en la región del UV. Por reacciones colorimétricas: Enlaces peptídicos o ciertos aminoácidos reaccionan y los productos coloridos son los que se cuantifican

8 PROTEÍNAS y la absorción en la región UV
Las bandas de absorción más significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente absorben en este rango las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos, la histidina y la cistina. La cistina presenta una banda centrada a 250 nm, n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy débil y el porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy pequeño en una proteína.

9 PROTEÍNAS Los aromáticos absorben de nm. La fenilalanina. Es el menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro complejo con múltiples bandas diferenciadas en torno a nm. Presenta también bandas de mayor energía que solapan con el espectro del enlace peptídico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribución al espectro en la zona del ultravioleta cercano de proteínas suele ser pequeña. La tirosina presenta un máximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonación del OH del anillo aromático. El triptófano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el espectro centrado a 280 nm. También presenta bandas en la zona del UV lejano.

10 calcular la concentración de proteínas: método UV
Se usará la ecuación de Lambert y Beer. El coeficiente de extinción molar de la Albumina de Suero Bovino (BSA) que es M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solución de BSA al 1% (10 mg/mL) La fórmula para determinar la concentración de la muestra.

11 Desarrollo experimental Determinación de proteínas por el método Abs 280 nm.
 Descongelar sólo las alícuotas de las fracciones de proteína destinadas para este protocolo y que fueron recolectadas durante la purificación de la lactato deshidrogenasa. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento. Colocar las fracciones en cuvetas de metacrilato grado UV. Leer la absorbancia las fracciones que te indique tú profesor a la longitud de 280 nm.

12 Concentración (µg/µL)
Calcular la concentración de proteínas con la fórmula y llenar la tabla Tubo Absorbancia Concentración (µg/µL) F0 F1 F2 F3 F4 FPA FPB NO SE NECESITA HACER CURVA PATRÓN

13 Pero para los métodos colorimétricos se necesita una: Curva Patrón
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina) que se utiliza para determinar la cantidad de proteínas presente en una muestra incógnita. En determinaciones colorimétricas, se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca. La intensidad de color se mide con un espectrofotómetro o colorímetro en función de las concentraciones crecientes de la sustancia se obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de proteína, mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color.

14 BLANCO La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmitancia.

15 CURVA PATRÓN

16 BIURET Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

17 Reacción de Biuret La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

18 Biuret La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

19 LOWRY ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA FORMACIÓN DE UN COMPEJO COBRE - PROTEÍNA EN SOLUCIÓN ALCALINA. ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO QUE PRODUCE UNA INTENSA COLORACIÓN AZUL.

20 Este método consta de dos etapas:
Primera reacción Biuret. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. Segunda reacción reactivo de Folin- Ciocalteau. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin- Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin‑Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

21 BIBLIOGRAFÍA O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: (1951) Este método se basa en la reacción de Biuret, donde los enlaces peptídicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo Cu+, después se reduce el reactivo de Folin por las proteínas tratadas con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la segunda reacción (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente debida a los aminoácidos tirosina, triptófano, y en menor grado por cisteína, cistina e histidina.

22 BRADFORD Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.

23 Bradford El ensayo de Bradford es un ensayo colorimético para la medición de proteína total en una solución dada. Involucra la unión de un colorante el Coomassie ® Brilliant Blue a las proteínas en un medio ácido y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a 595 nm. Debido a que el reactivo causa la precipitación de la proteína con el tiempo, la linearidad de la reacción se encuentra comprometida. Las mediciones hay que concluirlas rápidamente.

24 Diferentes El azul de Coomassie se une aproximadamente estequiométrica, entonces el método de detección tanto en solución como en PAGE-SDS, gel u otras matrices es el método preferido, cuando las concentraciones de proteínas se deben determinar por densitometría.

25 Cambio de absorbancia del coomasie blue
Los aminoácidos que son reconocidos por el colorante son arginina, fenilalanina, triptofano y prolina. El azul de Coomasie libre se detecta a 470 nm mientras que la forma unida a proteínas a 595 nm. Lo anterior debido a que el Coomassie se une preferencialmente a los aa mencionados y cambio de un estado catiónico a uno iónico

26 El azul de coomasie y los aminoácidos que reconoce

27 Cu1+ + BCA complejo púrpura BCA- Cu1+
El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. OH- Proteína + Cu Cu1+ Cu1+ + BCA complejo púrpura BCA- Cu1+

28 Cuadro comparativo de sensibilidad de las técnicas de cuantificación de Proteínas

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