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D ETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Comparación de métodos.

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1 D ETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS Comparación de métodos

2 B IURET La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO 4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu 2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.

3 R EACCIÓN DE B IURET La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.

4 VALORACION DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color de la disolución resultante proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert Beer (ver apartado de fotometría).

5 E STE MÉTODO CONSTA DE DOS ETAPAS : Los iones Cu 2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu 2+ -proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu 2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato. La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

6 R EACCIÓN ENTRE LA PROTEÍNA Y LO REACTIVOS BIBLIOGRAFÍA O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: (1951)

7 B RADFORD El ensayo de Bradford es un ensayo colorimético para la medición de proteína total en una solución dada. Involucra la unión de un colorante el Coomassie ® Brilliant Blue a las proteínas en un medio ácido y su conmitante cambio de absorbancia de 465 a 595 nm.Coomassie Debido a que el reactivo causa la precipitación de la proteína con el tiempo, la linearidad de la reacción se encuentra comprometida. Las mediciones hay que concluirlas rápidamente.

8 D IFERENTES El azul de Coomassie se une aproximadamente estequiométrica, entonces el método de detección tanto en solución como en PAGE-SDS, gel u otras matrices es el método preferido, cuando las concentraciones de proteínas se deben determinar por densitometría.

9 C AMBIO DE ABSORBANCIA DEL COOMASIE BLUE Los aminoácidos que son reconocidos por el colorante son arginina, fenilalanina, triptofano y prolina. El azul de Coomasie libre se detecta a 470 nm mientras que la forma unida a proteínas a 595 nm. Lo anterior debido a que el Coomassie se une preferencialmente a los aa mencionados y cambio de un estado catiónico a uno iónico

10 E L AZUL DE COOMASIE Y LOS AMINOÁCIDOS QUE RECONOCE

11 R ESUMEN


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