Inmunoréplica tipo Western

Presentación del tema: "Inmunoréplica tipo Western"— Transcripción de la presentación:

1 Inmunoréplica tipo Western
Mayo, 2013 Dra. Sobeida Sánchez Nieto

2 Western blot o inmunoréplica tipo Western
Es una técnica analítica que es usada para detectar específicamente a las proteínas de una muestra, mediante el uso de anticuerpos. La técnica necesita la separación inicial de la muestra a través de un un gel de poliacrilamida en el que se separaron primero las proteínas ya sea en base a su peso molecular (PAGE-SDS, una dimensión) o bien en base a su carga y peso molecular (PAGE- SDS; 1 o 2 dimensiones).

3 Transferencia de biomoléculas de soporte semisólido a sólido.
Técnica que fue descrita por Southern en para la transferencia de DNA en geles de agarosa a membranas de nitrocelulosa. Después se utilizó para la transferencia de RNA a membranas, Northern. Finalmente se transfirieron proteínas a membranas, Western.

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5 Pasos para el Western Separación de proteínas en gel de poliacrilamida. Transferencia de las proteínas a la matriz sólida (membrana) Tinción de proteínas en la membrana (opcional) Bloqueo Detección de la proteína de interés: Reacción con el primer anticuerpo Reacción con el segundo anticuerpo

6 1. Separación de las proteínas en un gel de poliacrilamida-SDS

7 2. Transferencia de proteínas
Hay dos tipos de aparatos y por tanto de dos formas diferentes para transferir proteínas del gel al soporte sólido: transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras que se llenan de amortiguador y transferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámaras y por tanto no necesitan tal cantidad de amortiguador.

8 1 2 1 2

9 Condiciones de transferencia:
Amortiguador de transferencia: 25 mM Tris, 190 mM glicine, 20% MeOH, pH Cuando son proteínas de alto peso molecular añadir 0.05% SDS. Corriente y tiempo aplicado para la transferencia en cámara húmeda Peso molecular Condiciones 1 Condiciones 2 < 20 kDa 1 A /45 min 250 mA/ 3 h <120 kDa 1 A/60 min 250 mA/ 4 h >120 kDa 1A / 90 min 250 mA/ 6 h >250 KDa 1A /105 min 500 mA/3.5 h

10 Ensamblar el sandwich Polo positivo Ojo! polo negativo

11 Añadir buffer Colocar en agitación

12 Proteínas

13 3. Tinción de la membrana Verificar que las proteínas fueron transferidas a la membranas. Determinar si los carriles fueron cargados de manera similar. Evaluar la eficiencia de la transferencia. Identificar bandas de proteínas para enviar a secuenciar. Hay muchos tipos de tinciones posibles, incluyendo colorantes orgánicos como Rojo de Ponceau, amido black, fast green, azul de Coomasie, colorantes fluorescentes y particulas coloidales (oro, plata, cobre, hierro)

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15 Tinción de proteínas en la membrana
Si la membrana se usa para tinción colorimétrica (segundo anticuerpo) usar la tinción reversible de Rojo de Ponceau S. Tinción en la que una solución 0.1% de Rojo de Ponceau en 5% ácido acético se deja por 5 min. Se visualizan las bandas de proteína. Remover el colorante lavando con agua hasta que las bandas desaparezcan (se puede añadir 0.1 M NaOH), lavar y luego bloquear.

16 Calf liver proteins were visualized after electroblotting to Immobilon-P membranes: (A) Transillumination, (B) Coomassie™ Brilliant Blue, (C) Ponceau-S red, (D) Amido black and (E) CPTS total protein stains. Left to right, molecular weight standards and 12.2 μg, 6.1 μg, 3.1 μg of the lysate per lane. Membranes can be stored dry for long periods of time after proteins have been transferred with no ill effects to the membrane or the proteins (up to two weeks at 4°C; up to two months at -20°C; for longer periods at -70°C).

17 4. Bloquear la membrana La membrana puede unir proteínas
Proteínas como los anticuerpos o las de la muestra. Para que no haya una unión inespecífica del anticuerpo en zonas en donde no hay proteínas (entre bandas) o bien que se una a proteínas que no son la de interés, se debe BLOQUEAR LA UNIÓN NO ESPECIFICA. Para lograrlo se añade una solución diluida de proteína, la cual se une en todos los lugares en donde no hay proteína (allí más que en otros lados). Por lo que el anticuerpo se une de manera preferencia a sitios en donde hay proteína con la conformación o aminoácidos blanco (proteína de interés). Leche descremada, BSA, gelatina y a veces se añade Tritón o Nonidet (ambos detergentes)

18 5. Detección Directa Indirecta Anticuerpo primario Anticuerpo primario
Marcado No marcado

19 Segundo anticuerpo conjugado con una enzima

20 Resultados Múltiples bandas en el gel en el que se separaron las proteínas de las muestras La detección de la proteína de interés, una sola banda

21 Anti-LDH b

22 Técnica colorimétrica
Segundo anticuerpo Anti-IgG de conejo conjugado con fosfatasa alcalina Reactivos para fosfatasa, BCIP y NBT BC indoxyl intermediario Precipitado púrpura Sal de formazán insoluble. pp azul