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BIOLOGÍA MOLECULAR Erase una vez…
Dr. GERARDO DANIEL DELUCA Laboratorio de Aplicaciones Moleculares Facultad de Medicina-UNNE
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Los primeros pasos … PCR ADN Electroforesis QUENCHER ARRAYS ARN RFLP Hibridación Secuenciación DOT BLOT NASBA Clonación HIBRIDACIÓN REVERSA
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El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha…
Molar mMolar - uMolar L /mL/uL uLitro Grs/mgrs nGrs / fGrs. Moles mMoles /nMoles
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Dogma central de la biología molecular
DNA RNA PROTEINAS F. Crick
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El código genético
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Principales descubrimientos y avances de la era molecular
1960 Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA. 1962 Arber aisla y purifica las enzimas de restricción. 1967 Se descubre la ADN ligasa 1972 Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación 1975 Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas 1977 Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert) 1981 Primeros animales transgénicos 1985 Invención de la PCR (Kary Mullis) 1997 Secuenciación de genomas bacterianos completos 2001 Secuenciación del Genoma Humano
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Aplicaciones de la Biología Molecular
¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina? Los virus y las enfermedades virales Desórdenes metabólicos hereditarios Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales Cáncer Edward L. Tatum, Atomes 1968 Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos) Clonación de órganos y animales Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica) Medicina Personalizada Identificación de personas huella genética Paleontología
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PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCR
INVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES INVESTIGACIONES FORENSES MEDICINA HUMANA
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PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
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Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos)
TIPOS DE PCR CONVENCIONAL PCR común Nested PCR Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos) Heminested PCR PCR de baja astringencia (RAPD PCR) RT-PCR
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AMPLIFICACIÓN Más ampliamente utilizada
PCR Más ampliamente utilizada Distintos formatos caseros y comerciales NASBA Comercial Cargas virales y monitoreo bDNA
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MANUALES AUTOMATIZADOS
EXTRACCIÓN DE ADN O ARN MANUALES Con solventes Sin solventes AUTOMATIZADOS Robotizados Magnéticos y de vacío
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Hibridación con sondas marcadas
DETECCIÓN Electroforesis Hibridación con sondas marcadas LIPA Fluorescencia RLB ELISA
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Metodología utilizada:
HC V Metodología utilizada: RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) 100pb ACRILAMIDA / Nitrato plata 251pb AGAROSA / BrEt
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HPV PCR-RFLP PCR Ez de restricción GENOTIPO RFLP
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Micobacterias PCR-RFLP
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RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS
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HIBRIDACIÓN REVERSA RLB
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Inno-Lipa Micobacterias
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Curva de amplificación PCR
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Detección objetiva del amplicón Menor tamaño amplicones
Real time PCR Ventajas No se hace corrida Detección objetiva del amplicón Más sensible Multiplex Más rápida Menor tamaño amplicones Cargas virales
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Real time PCR
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Curva de melting
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Curva de melting
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TaqMan probes
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Molecular beacon probes
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
DETECCIÓN MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN EXTRACCIÓN DE ADN O ARN
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Amplificación isotérmica
Ej: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV) Lectura por electroquimioluminiscencia
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Branched DNA Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)
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Hibridación de captura HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria
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Secuenciación
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Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.
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DNA CHIP MICROARREGLOS DE DNA
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