Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. J.E. Olsen a* *, S. Aabo b, W. Hill ‘, S. Notermans d, K. Wernars,

Presentación del tema: "Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. J.E. Olsen a* *, S. Aabo b, W. Hill ‘, S. Notermans d, K. Wernars,"— Transcripción de la presentación:

1 Probes and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens. J.E. Olsen a* *, S. Aabo b, W. Hill ‘, S. Notermans d, K. Wernars, P.E. Granum e, T. Popovic f, H.N. Rasmussen a, 0. Olsvik 226259 Sánchez García Yanira Ivonne

2 Métodos rápidos de identificación. Hibridación de ADNPCR

3 Técnicas de ADN Cultivo Microbiológico Directamente de la comida

4 Introducción En 1980, Mosley et al. Escherichia coli enterotoxigénica En muestras clínicas en crudo por hibridación de colonias. Usando fragmentos clonados de los genes que codifican las toxinas LT y ST.

5 Hibridación Proceso más común para detectar un gen particular o un segmento de un ácido nucleico. La variante que mas se utiliza es el uso sondas. Sondas moleculares Fragmentos cortos y de una sola cadena de ADN o ARN, marcados con átomos radioactivos. Las sondas se aparean con secuencias específicas, que permiten la identificación de un fragmento determinado de ADN que forma parte de una molécula mucho mayor.

6 Técnica de hibridación de colonias.

7 Metodos de ADN para la detección de bacterias No se aplican en alimentos.

8 Puede deberse a… Dependen de los procedimientos tradicionales de cultivo. Dependen del uso de marcadores radioactivos.

9 Sin embargo, estos métodos son cada vez más utilizados. Presencia de enzimas inhibitorias Accesibilidad del organismo diana. Número de patógenos suele ser reducido y viene acompañado de un elevado número de microorganismos banales La normativa

10 Ensayos de diagnóstico. El principio esencial de los métodos de detección basados ​​en ácidos nucleicos es la específica formación de moléculas de ácidos nucleicos de doble cadena a partir de dos moléculas complementarias de cadena sencilla en las condiciones físicas y químicas definidas.

11 Hibridación. In vitroHibridación Una de las cadenas se produce en el laboratorio Sonda (H) Mientras que la otra hebra la proporciona el organismo diana.

12 La sonda y el ácido nucleico objetivo. Si se forman híbridos entre:

13 Hibridación de fase sencilla Hibridación de colonias

14 Reacción en cadena de la polimerasa. Un fragmento de ADN específico se amplifica durante un proceso cíclico de 3 pasos… El ADN diana se desnaturaliza a alta temperatura. 2 oligonucleótidos sintéticos (primers) son reconocidos por cadenas opuestas (hibridación) La polimerización se realiza con el oligonucleótido como cebador y el ADN como diana.

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16 Especificidad.

17 Bacterias patógenas específicas.

18 Salmonella. Salmonella Familia Enterobacteriaceae

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20 Método de cultivo estandarCultivoPruebas bioquímicas

21 Sondas de poli y oligonucleótidos para la detección de Salmonella. La falta de genes específicos para las toxinas u otros factores de virulencia. Se han seleccionado y estudiado al aza fragmentos cromosómicos clonados. Entre 1983 y 1992, se han publicado 6 diferentes sondas. 5 de las cuales son fragmentos de ADN críptico.ADN críptico

22 ADN críptico. Cuando no se tiene evidencia de que tipo de función realizan los genes que lleva un plásmido. En muchos casos si se puede asignar una función: Plásmidos Codificación a factores de virulencia. Plásmidos invPlásmidos ent Codificación a factores de resistencia a antibióticos Β- lactamasas plasmídicas. Codificación a plásmidos sexuales

23 Gopo et al. (1988) aislaron 1.8 kb de una sonda marcada de biotina. Confirmó la presencia de 40 seritopos sin reacciones cruzadas a 15 sepas no-Salmonella. Era tan sensible como la marcada con Radio. SalmonellaPares de basesRadio

24 Un fragmento de 1.8 kp identificó 327 cepas de Salmonella sin hibridación a 59 cepas no-Salmonella Una sonda de 2.3 kb hibridizó 396 cepas de Salmonella pertenecientes a 214 serotipos No hibridizó con 178 cepas no-Salmonella de 52 especies ertenecientes a 23 géneros

25 Sonda marcada con digoxigenina Sonda marcada con S 35 Técnicas no-isotópicas o colorimétricas Técnicas isotrópicas.

26 Estudios comparativos sobre los ensayos con sondas de hibridación. Métodos basados en ADN. Sondas desarrolladas por Fits et al. (1983) Cultivo estándar.

27 Wilson et al. (1990). Hibridación colorimétrica. 48 horas. Ha remplazado el jit de sondas de Fitss et al.

28 Brailey et al. (1991) Salmonella- Tek 99.6% I-2- TEST 92.8% Hibridación colorimétrica 97.5% Método de cultivo 91.2%

29 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de Salmonella. 7 ensayos de PCR. Widjojoatmodjo et al. (1991). Primers aislados de genes de replicación Partículas magnéticas cubiertas de anticuerpos específicos. Magnetic Inmuno- Polymerase chain reaction Assay (MIPA) Lisados bacterianos centrifugados 25 cepas de Salmonella y 19 cepas de no- Salmonella fueron identificados correctamente. PCR  limite de detección de 10 7 UFC7 g MIPA  limite de detección de 10 5 UFC7 g Rahn et al (1992) Utilizó cebadores seleccionados de la secuencia del ge de Inv A Salmonella 630 cepas de Salmonella. 575 pertenecían a 102 serotipos específicos 142 cepas de no- Salmonella de 21 géneros. Dos cepas de cada una de las subespecies Iserotipos: S. Senftenberg y S. litchfield dieron resultados negativos falsos. Way et al. (1993) Cebadores creados a partir de H-li y el gen Hin flagelin Salmonela móvil.

30 Microbiología de alimentos E. coli Vibrio Yersinia enterocolitica Campylobacter Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Baciluis cereus Clostridium perfinges Clostridium botulinum

31 CONCLUSIONES.