Deforestación Mundial Necesidad de 18.000ha de cubierta forestal Amortiguar impactos ambientales: Limitación de los viveros en la multiplicación de forestales.

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2 Deforestación Mundial Necesidad de 18.000ha de cubierta forestal Amortiguar impactos ambientales: Limitación de los viveros en la multiplicación de forestales La necesidad de grandes cantidades de ejemplares de especies nativas forestales - proyectos de Forestación y Reforestación MDMQ  Prácticas tradicionales de cultivo  Obtención rápida y masiva de ejemplares  Mejoramiento de árboles forestales  Gran cantidad de mano de obra  Requerimiento de amplio espacio CIAC => promueve biotecnologías agronómicas CALLOGENESIS en Caesalpinia spinosa o Especie nativa forestal o En peligro en extinción o Protección a suelos erosionados o Potencial industrial El año 2001, DMQ existía aprox. 9.000ha de bosques naturales y plantaciones forestales.

3 Desarrollar un protocolo de desinfección efectivo para el establecimiento in vitro de cotiledones y ejes embriogénicos de semillas maduras de Guarango. Determinar el medio de cultivo más adecuado para la inducción a callo embriogénico en cotiledones y ejes embriogénicos. Evaluar el efecto de las combinaciones y concentraciones de los reguladores de crecimiento en la fase de inducción a callo de cotiledones y ejes embriogénicos. Analizar de manera morfológica e histológica los callos generados en la fase de inducción. Inducir a la formación de callo embriogénico a partir de cotiledones y ejes embriogénicos de semillas maduras de árboles de Guarango (Caesalpinia spinosa) para promover una vía de proliferación masiva. General

4 Guarango (Caesalpinia spinosa) (Molina) O. Kuntze  4 a 8 metros de altura  Ramas contienen espinas  Hojas son compuestas, bipinadas, alternas en espiral  Frutos son legumbres aplanadas y curvas, que cambian de color, según su madurez de verde a rosado y finalmente rojo parduzco; de 5 a 10 cm de largo.  Árbol nativo de los Andes, 1500 a 3100 msnm  Ecuador: Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi, Tungurahua, Chimborazo, Azuay y Loja  Mancha blanca (Oidium)  Queresas y áfidos en hojas y en frutos

5  Consta de un embrión  Eje embriogénico o embrionario  Endospermo  Cubierta seminal  Dicotiledónea Capacidad germinativa que oscila entre 80 y 90%. Germinación epigea, inicia entre los 8 a 12 días y finaliza a los 20 días. Requiere un método de escarificación como tratamiento pre-germinativo. Capacidad germinativa que oscila entre 80 y 90%. Germinación epigea, inicia entre los 8 a 12 días y finaliza a los 20 días. Requiere un método de escarificación como tratamiento pre-germinativo. Protección y recuperación de suelos por proceso de erosión – Fijación N 2 En asociación con cultivos mejora capacidad productiva Potencial productivo de taninos Excelente adaptabilidad

6 EMBRIOGÉNESIS SOMATICA INDIRECTA CAULOGÉNESIS ORGANOGÉNESIS

7 Semillas maduras de plantas adultas de Caesalpinia spinosa Desinfección química Carboxin – Captan Desinfección química Carboxin – Captan Banco de semillas del vivero de Cununyacu de la EPMMOP-Q (-5°C) Ensayo Final de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones Ensayo Preliminar de Inducción a callo embriogénico a partir de Ejes embriogénicos y Cotiledones Desinfección y establecimiento de Ejes embriogénicos y Cotiledones Identificación del callo embriogénico

8 Solución 1:100 Detergente LAVADO - DETERGENTE 40 min agitación Triple enjuague Escarificación con cautín en la zona del micrópilo Semillas en agua destilada por 2días

9 TRATAMIENTOS PARA DESINFECCIÓN Ensayos Hipoclorito de sodio (NaClO) (v/v) % Tiempo (min) 10.55 21.55 30.510 41.510 Preparación medio MS Siembra de los explantes Retirar la testa de la semillas y separar los cotiledones de los ejes Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

10 TRATAMIENTOS PRELIMINARES DE INDUCCIÓN MedioTratamientoReguladores de crecimiento (mg.L -1 ) M S Control 1- T12, 4-D (2 mg.L -1 ) + Kin (1 mg.L -1 ) T22, 4-D (1 mg.L -1 ) + BAP (0.5 mg.L -1 ) T3TDZ (0.2 mg.L -1 ) + AIA (0.05 mg.L -1 ) Gamborg B5 Control 2 - T42, 4-D (2 mg.L -1 ) + Kin (1 mg.L -1 ) T52, 4-D (1 mg.L -1 ) + BAP (0.5 mg.L -1 ) T6TDZ (0.2 mg.L -1 ) + AIA (0.05 mg.L -1 ) Desinfección Siembra de los explantes Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

11 Desinfección TRATAMIENTOS FINALES DE INDUCCIÓN Medio MS TratamientoReguladores de crecimiento (mgL -1 ) Control 1- T12, 4-D (1 mg.L -1 ) + Kin (0.5 mg.L -1 ) T22, 4-D (2 mg.L -1 ) + Kin (1 mg.L -1 ) T32, 4-D (4 mg.L -1 ) + Kin (2 mg.L -1 ) Control 2- T4TDZ (0.1 mg.L -1 ) + AIA (0.025 mg.L -1 ) T5TDZ (0.2 mg.L -1 ) + AIA (0.05 mg.L -1 ) T6TDZ (0.4 mg.L -1 ) + AIA (0.10 mg.L -1 ) Extracción y Siembra de: cotiledones Incubación a 25 ±2°C fotoperiodo de 24 h oscuridad

12 Explantes Vivos en Cotiledones y Ejes Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos. Porcentajes de cotiledones y ejes embriogénicos vivos y descartados, evaluados a los 25 días de haber sido establecidos

13 Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis COTILEDONES Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte.

14 Contaminación bacteriana, fúngica y necrosis EJES EMBRIONARIOS Diagrama de dispersión del análisis de componentes (tiempo de exposición de los cotiledones al hipoclorito vs la concentración de NaClO) de los tratamiento de desinfección para cada una de las condiciones de descarte.

15 Formación de callo a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días. FI

16 Tiempo de formación de callo a partir de Cotiledones Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo

17 Morfología de callos formados a partir de Cotiledones Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en cotiledones. Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los cotiledones, por combinación de conglomerados re-escalados.

18 Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días

19 Formación de callo a partir de Ejes embrionarios Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación y ausencia de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días.

20 Tiempo de formación de callo a partir de Ejes Porcentajes de callo formados en ejes embriogénicos a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo.

21 Morfología de callos formados a partir de Ejes Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de las características macro-morfológicas de los callo formados en ejes embriogénicos. Análisis cluster jerárquico de los callos formados en los ejes embriogénicos, por combinación de conglomerados re- escalados.

22 Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos y no embriogénicos en ejes e., evaluados a los 60 días

23 Formación de callo Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de la formación, ausencia de callo y callos descartados en cotiledones, evaluados a los 60 días. PI

24 Tiempo de formación de callo Porcentajes de callo formados en cotiledones a los 15, 30, 45 y 60 días en los tratamientos de inducción a callo 2,4D + KinTDZ + AIA

25 Morfología de los callo Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes del color y textura de los callo formados en cotiledones. Según la textura y el color expresado en el callo formado se identifica el tipo de callo es decir si es embriogénico o no ya que depende del tratamiento.

26 Tabla de contingencia de frecuencias y porcentajes de callos formados, callos embriogénicos y no embriogénicos en cotiledones, evaluados a los 60 días. Porcentajes de callos embriogénicos, no embriogénicos y ausencia de formación de callo en cotiledones, evaluados a los 60 días

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29 Para disminuir el porcentaje de necrosis en la desinfección de cotiledones y ejes embriogénicos se deberá probar nuevos procesos de desinfección basado en la utilización de peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) puesto que ha presentado buenos resultados en la desinfección de semillas de otras especies. Con base en los resultados obtenidos, se podría probar nuevas combinaciones y concentraciones adicionales de auxinas y citoquininas para la obtención de callos embriogénicos en ejes embriogénicos. Es importante realizar otro tipo de estudios histológicos con la finalidad de identificar estructuras adicionales a las ya señaladas para tener un mayor conocimiento referente a los procesos de la callogénesis in vitro en cotiledones de Caesalpinia spinosa que permita ampliar su entendimiento. Continuar la investigación, tendiente a lograr un protocolo eficiente de embriogénesis somática indirecta en cotiledones y ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpinia spinosa. Ya que se generaron posibles vías de organogénesis en los ejes embriogénicos de semillas maduras de Caesalpinia spinosa, se puede continuar el estudio ésta ruta in vitro de generación masiva de plantas.