ELECTROFORESIS Equipo 5 Trejo Mendiola Brenda Isabel.

Presentación del tema: "ELECTROFORESIS Equipo 5 Trejo Mendiola Brenda Isabel."— Transcripción de la presentación:

1 ELECTROFORESIS Equipo 5 Trejo Mendiola Brenda Isabel

2 ¿QUÉ ES? Es el procedimiento del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento.

3 El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. ¿En qué consiste?

4 La electroforesis se puede clasificar de dos maneras:
¿Cómo se clasifica? La electroforesis se puede clasificar de dos maneras: Vertical y horizontal *En la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN *En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas,

5 Principales tipos de electroforesis
Electroforesis en Gel de Agarosa Electroforesis en geles de Poliacrilamida Electroforesis en Acetato de Celulosa Electroforesis en papel

6 Electroforesis en Gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio.

7 Se coloca un buffer de electroforesis
Añadimos el gel de agarosa (previamente puesto a baño maría) con 25 ml son suficientes Peinar hasta que el gel de agarosa quede como una capa uniforme y esperar un lapso de 20 min para que seque Se coloca un buffer de electroforesis Se colocan las muestras en el pocillo Conectamos el ánodo y el cátodo a la fuente de poder y seleccionar el voltaje adecuado (75 – 100 volts)

8 Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de teflón conteniendo bromuro de etidio a una concentración de 1μg/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo. Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV. Depositar el gel cuidadosamente sobre la pantalla del transiluminador. Las moléculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro de etidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las moléculas de ADN que son más grandes, generalmente migran más retardadamente que las moléculas de menor peso

9 Electroforesis en Gel de poliacrilamida
En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar de acuerdo a su peso molecular. Dicha distribución será afectada por la concentración del gel

10 Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dos
tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN. Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer. Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volúmenes de solución que contiene el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN . Acto seguido, añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente. Mediante el uso de puntas de 20 μl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo

11 Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado ( voltios). Separar el gel de los vidrios con mucho cuidado a que es muy frágil y puede romperse. sumergirlo en fijador durante 15 min, en un recipiente tapado, teñir el gel durante 1 hr con azul Coomassie y Eliminar luego el exceso de colorante.

12 Electroforesis en acetato de celulosa
Una de las técnicas clásicas y más sencillas Son químicamente más homogéneas y transparentes y nos permiten separar lipoproteínas

13 1. Sumergir las tiras de acetato de celulosa durante al menos 10 minutos en la solución tampón.
2. Absorber el exceso de tampón de las tiras colocándolas entre 2 hojas de papel de filtro. 3. Colocar las tiras en el puente con la cara mate hacia arriba (la esquina cortada debe quedar abajo a la derecha). 4. Realizar la siembra de la muestra a 1 cm del extremo catódico. 5. Conectar la fuente de alimentación a 200 v. durante 60 minutos (una vez pasado el tiempo desconectar el alimentador). 6. Revelado: a) teñir las tiras con solución colorante durante 5 minutos. b) Decoloración: lavar las tiras 3 ó 4 veces con la solución decolorante agitando levemente hasta obtener un fondo blanco. 7. Cuantificación: Colocar las tiras extendidas sobre portaobjetos y dejar 24h hasta que se transparenten completamente. Para acelerar el proceso de transparentado es conveniente colocarlas bajo la luz del flexo durante unos minutos. Una vez transparentadas leer el proteinograma obtenido en el fotodesnsitometro, introduciéndole el valor de proteínas totales obtenido por refractometria para realizar la cuantificación de cada fracción proteica.

14 Electroforesis en papel
La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados los electrodos.

15 Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigración de una molécula, depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensión y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...). El revelado se realiza empleando los colorantes adecuados. La electroforesis y la cromatografía en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras que la electroforesis separa las moléculas fundamentalmente en función de su carga, la cromatografía lo hace en base a una amplia gama de características (solubilidad en la cromatografía de reparto, polaridad en la de adsorción, carga en la de intercambio iónico, etc.).

16 Otros tipos de Electroforesis
Con base a los métodos anteriores se presentan algunas modificaciones (variantes) como: *Electroforesis en campo pulsado *La electroforesis bidimensional *Electroforesis de capilaridad

17 Electroforesis en campo pulsado
Es una técnica diseñada especialmente para la separación de ADN de alto peso molecular (>100 kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes campos eléctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migración del ADN hacia diferentes direcciones facilitando la separación de dos grandes moléculas de ADN.

18 Electroforesis Bidimensional
Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentes de corrida en ángulo recto uno de otro. En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su carga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing). Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular y nos permite resolver 2500 manchas de polipéptidos.

19 Electroforesis capilar
Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílica fundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetro de 25 a 100 μm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa. Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales tenemos: proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidos orgánicos y células en general. En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la eficiencia de separación es muy alta

20 Bibliografía MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA PROTEÍNAS Y ADN Blgo. Carlos Augusto Yábar Varas

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