INMUNOCITOQUÍMICA fijación con metanol TRANSFECCIÓN ANALISIS POR

Presentación del tema: "INMUNOCITOQUÍMICA fijación con metanol TRANSFECCIÓN ANALISIS POR"— Transcripción de la presentación:

1 INMUNOCITOQUÍMICA fijación con metanol TRANSFECCIÓN ANALISIS POR
CÉLULAS EN MONOCAPA TRANSFECCIÓN FIJACIÓN (paraformaldehído o gluteraldehido) fijación con metanol (fija y permeabiliza a la vez) PERMEABILIZACIÓN BLOQUEO ANALISIS POR MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA LAVADOS ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO

2 Manipulación de células en cultivo:
1) MEDIO DE CULTIVO Requerimientos Aporte Composición *glucosa (fuente de C) *aminoácidos (fuente de N) *cofactores enzimáticos *vitaminas *sales Nutrientes MEDIO DE CULTIVO *Transferrina *Albumina, *Factores de crec. *Factores de anclaje Estimulo proliferativo y adhesivo SUERO *penicilina *estreptomicina *gentamicina ANTIBIOTICO Prevención de contaminaciones *hormonas *Factores de crec. SUPLEMENTO Estimulo especifico *Bicarbonato *Indicador: Rojo Fenol Mantiene el PH BUFFER

3 2) FACTORES FISICOQUIMICOS
PH: OSMOLARIDAD : mOsmol/kG CO2: 2-5 % TEMPERATURA: ºC 3) ESTERILIDAD 1) Manipulación de células en flujo laminar 2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a trabajar 3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%

4 Tipos de transfección:
1) Coprecipitación por fosfato de calcio 2) Electroporación 3) DEAE-Dextran y Polibreno 4) Fusión de protoplastos 5) Lípidos cationicos (Liposomas) 6) Métodos Mecánicos *Microinjección *Biobalistica (gene gun)

5 Fijación La función de la fijación es preservar la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos lo mas fielmente posible a lo que ocurre en la realidad. Gluteraldheído Paraformaldheido Metanol/Acetona Modo de acción Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por precipitación de proteínas y carbohidratos Uso mas frecuente Microscopia electrónica y algunos estudios de fluorescencia Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos Gran variedad de estudios ventajas/ desventajas *provee la mayor preservación de la estructura fina *es el mas severo delos fijadores *en gral. Altera los epitopes *provoca fluorescencia inespecifica *produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído *menor cantidad de puentes que el gluteraldheído *penetra mas rápidamente dentro de la célula. *fijación mas rápida que el aldheído *frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos *antígenos solubles pueden perderse *contracción de la muestra

6 Micela de detergente e agua
PERMEABILIZACION Micela de detergente e agua

7 Ruptura de la membrana por detergente.

8 ANTICUERPOS Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas . La molécula que induce la producción de anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

9 Anticuerpos Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por
diferentes clones de linfocitos Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno. Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos Población de anticuerpos homogéneos, reconoce un único epitope del anticuerpo

10 Anticuerpos policlonales
Conejo, cabra, oveja, etc. Purificación de anticuerpos Separar el suero

11 Anticuerpos monoclonales
Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.

12 Anticuerpos monoclonales
Células de mieloma Fusión Células productoras de anticuerpos hibridomas Producción de anticuerpos monoclonales

13 Anticuerpos monoclonales
Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un único epitope Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. Desventajas: Mayor costo

14 Inmunofluorescencia DIRECTA INDIRECTA primario secundario
Anticuerpo marcado con fluoróforo primario secundario Ventajas Mayor sensibilidad El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario

15 Inmunofluorescencia indirecta
Células fijadas y permeabilizadas

16 Inmunofluorescencia indirecta
Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

17 Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo primario (IgG) anti-tubulina (producido en conejo) anti-vinculina (producido en conejo)

18 Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo secundario Anti-Conejo (producido en cabra)

19 Inmunofluorescencia indirecta
Microscopio de fluorescencia

20 GFP-PTP 1B DA VINCILUNA

21 ACTINA/NUCLEO/RETICULO

22 VINCULINA/NUCLEO/RETICULO

23 MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS