Proteasas Parasitarias

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1 Proteasas Parasitarias

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3 Proteasas Definición Se trata de enzimas capaces de hidrolizar los enlaces peptídicos (subclase E.C 3.4) Proteólisis limitada: limitado número de enlaces hidrolizables Proteólisis ilimitada: proteasoma, lisosomas

4 Enlace Peptídico Características
Plano Rígido Polar Restringe conformación de la cadena polipeptídica

5 El Problema Químico

6 Proteasas Nomenclatura

7 Proteasas Nomenclatura de Schercher y Berger

8 Proteasas Clasificación según mecanismo de acción
Serina proteasas Cisteína proteasas Metaloproteasas Aspártico proteasas Treonina proteasas Glutámico proteasas

9 Proteasas Clasificación
Familia: homología significativa a nivel de secuencia de amino ácidos en la porción catalítica. Clan: Grupos de familias que han evolucionado a partir de una proteína ancestral. Similitud a nivel de estructura tridimensional

10 Proteasas en los Genomas Eucariotas

11 Serina proteasas Generalidades
Familia de Qumiotripsina: Tripsina, elastasa, factores de la coagulación XIIa, XIa, IXa, plasmina Familia Subtilisina, enzimas bacterianas Tríada catalítica

12 Serina Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica
Tríada Catalítica: His57, Asp102 y Ser195 -Formación de acil intermediario entre el substrato y la Ser Formación de este intermediario covalente se produce a través de un intermediario tetrahédrico de transición cargado negativamente Se cliva el enlace peptítico

13 Serina Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica (cont.)
Fase de deacilación El intermediario acil-enzima se hidroliza por una molécula de agua liberado el péptido y restaurando el hidroxilo en Ser La His provee una base y acepta el OH de la Ser reactiva

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15 Cisteína Proteasas Generalidades
Papaína, catepsinas lisosomales B, H y L Calpaínas citosólicas Díada catalítica: Cis25, His159 juegan los mismos roles que Ser e His en serina proteasas

16 Cisteína Proteasas Mecanismo de Acción Catalítica
La catálisis también se produce a través de la formación de un intermediario covalente e involucra a Cys e His El nucleófilo es en este caso un ion tiolato en lugar de un grupo hidroxilo El tiolatio se estabiliza por la formación de un par iónico con el imidazol vecino en la His El ataque nuclefílico es en este caso el par iónico tiolato-imidazol en ambos pasos, por tanto no se requiere una molécula de H2O2

17 Metaloproteasas Generalidades
Amplias differencias en secuencias y estructura La gran mayoría contienen Zn en sitio activo Ej: Termolisina, metaloproteasas de la matriz extracelular (MMPs), algunas aminopeptidasas Sito activo de la termolisina mostrando Zn, HIS142, HIS146 and GLU166.

18 Metaloproteasas Mecanismo de Acción
El mecanismo catalítico lleva a la formación de un intermediario tetrahédrico no covalente luego del ataque de la molécula de H2O unida al Zn sobre el grupo carbonilo del enlace peptídico. El intermediario se descompone por la transferencia del protón del ácido glutámico al grupo NH

19 Aspártico Proteasas Generalidades
Ejemplos: Familia de la Pepsina:catepsina D, renina Familia de proteasas del HIV (retropepsina). Son monoméricas, por lo que la dimerización se requiere para formar la enzima activa Se trata de enzimas bilobuladas donde el sitio activo está entre dos lóbulos homólogos. Cada lóbulo contribuye con un aspartato El pH óptimo es ácido para la mayoría de las aspártico proteasas, donde un protón está compartido por los dos aspartatos del sitio activo El agua es activada por los aspartatos para realizar el ataque nucleofílico

20 Aspártico Proteasas Mecanismo de Acción
Los 2 residuos aspartil tienen una gran proximidad geométrica en la molécula Un aspartato se ioniza mientras que el segundo no lo está al rango de pH óptimo de 2-3 La catálisis de las aspártico proteasas no involucra la gneración de un intermediario covalente si bien existe un intermediario tetrahédrico. El ataque nucleofílico se consigue por 2 transferencias simultáneas de protones: una desde el H2O2 a la díada de dos carboxilos y otra desde la diáda al oxígeno carbonilo del substrato con el consiguiente clivaje CO-NH En términos generales es una catálisis ácido-base.

21 Inhibidores de Proteasas Bajo Peso Molecular
Cisteína: E-64, Leupeptin Serina: Di isopropilfluorofosfato (DFP), PMSF, Benzamidina, Dicloroisocumarina Metalo: EDTA, EGTA, Fenantrolina, Bestatina Aspártico: Pepstatina

22 Inhibidores de Proteasas Inhibidores Naturales
Mas de 100 compuestos naturales identificados Desde bacterias a animales y plantas Reversibles o seudo-irreversibles Impiden acceso al sitio activo Proteicos, de 50 a 400 aa Clase específicos excepto familia de α- Macroglobulina Inhibidores de Serina y Cisteína proteasas son los mejor caracterizados. Ej. α-1 antitripsina y cistatinas

23 Metodología de Estudio Substratos Cromogénicos
Estos substratos, al clivarse generan un compuesto cromogénico. La tasa de hidrólisis se mide en Los más utilizados son péptidos 4-nitroanilides pNA) y péptidos thioesteres

24 Metodología de Estudio Sustratos Fluorgénicos
Generan un compuesto fluorogénico al producirse el clivaje. La tasa de hidrólisis se cuantifica por medio de un espectrofluorómetro o fluorómetro en forma continua o ensayos puntuales. Los sustratos más usados son los que tienen acoplado AMC (peptidyl 4-metil-7 cumarilamidas).

25 Metodología de Estudio Sustratos con Quenching intramolecular
En estos substratos, la secuencia peptídica separa un grupo fluorescente dador de un grupo aceptor que actúa como mitigador (quencher) de fluorescencia. El fenómeno se llama transferencia de energía resonante. El clivaje del enlace peptídico lleva a separación del par dador-aceptor produciendo un incremento de la fluorescencia. Existen varios pares de dador-aceptor reportadoss, por ej. o-aminobenzoic acid (Abz) como dador y 2, 4 dinitrophenyl (Dnp) como aceptor.

26 Substratos sintéticos Ejemplos
Cathepsin B Bz-Arg-pNA Pyr-Phe-Leu-pNA Z-Arg-Arg-pNA Z-Phe-Arg-pNA Z-Arg-Arg-MCA Z-Phe-Arg-MCA Cathepsin G MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Met-pNA Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Val-Pro-Phe-pNA Suc-Phe-Leu-Phe-pNA – Cathepsin H H-Arg-pNA Bz-Arg-pNA H-Arg-MCA Cathepsin L Z-Phe-Arg-pNA Z-Phe-Arg-AMC

27 Geles de gelatina-SDS-PAGE
CL1 gelatinolytic activity CL2 29 kDa CL1 27,5 kDa CL2 gelatinolytic activity

28 SDS-PAGE acoplado a Substratos Fluorogénicos

29 Acciones de las Proteasas Parasitarias en el Contexto del Parasitismo
Invasión Migración Nutrición Evasión de la respuesta inmune Inmunomodulación

30 Invasión y Migración Membranas Basales y Matríz Extracelular

31 Nutrición Hemoblobina Proteínas del suero Proteínas intracelulares
Proteínas extracelulares (MEC)

32 Evasión de la Respuesta Inmune
Degradación de Igs (IgG, IgM, IgE, IgA) Degradación de componentes del Complemento Clivaje de moléculas de superificie de células del sistema inmune (Ej. CD4)

33 Inmunomodulación La cisteína proteasa CPB2.8 de Leishmania mexicana induce una fuerte respuesta de tipo Th2 asociada a la progresión de la enfermedad

34 Enfermedad de Chagas Causada por el flagelado Trypanosoma cruzi
Parásito heteroxeno 3 formas: Forma replicativa intracelular obligatoria amastigote, forma tripomastigote circulante y forma epimastigota replicativa en el insecto vector

35 Proteasas de Trypanosoma cruzi Cisteína proteasas
Cruzipaína (cruzaína, GP57/51) Catepsina B-like proteinasas CAAX Prenyl proteasa

36 Proteasas de Trypanosoma cruzi Serina proteasas
Oligopeptidasa B Prolil Endopeptidasa Tc80 (colagenasa) Serina carboxipeptidasa

37 Proteasas de Trypanosoma cruzi Metaloproteasas
Genes pertenecientes a la familia gp63 de Leishmania, una metaloproteasa asociada a membrana celular han sido descritos en T. cruzi.

38 Cruzipaína Responsable de la actividad cisteína proteasa más promienente de T. Cruzi Se expresa en todos los estadíos parasitarios La mayoría tiene localización lisosomal, pero hay isoformas asociadas a membrana plasmática y habría alguna secretada Endoproteasa, digiere proteínas como caseína, SAP, hemoglobina y sustratos sintéticos a pH 7-9. Prefiere Arg o Lys en P1 y un hidrofóbico o con carga + en P2 (Leu>Tyr>Phe>Val)

39 Cruzipaína Especificidad intermediaria entre Catepsinas L y B en función de AA en P2 Inhibida por organomercuriales, E-64, leupeptin, TLCK, cistatina, stefina, chagasina y derivados peptidil fluorometanos Peptidos con secuencia YHNGAA del pro-dominio también la inhiben Z-Phe-Ala-fluorometilketona E-64

40 Cruzipaína Corte de subclases de IgG

41 Cruzipaína Corte de subclases de IgG

42 Cruzipaína Corte de subclases de IgG

43 Malaria Causada por protozoarios apicomplexa del género Plasmodium
300 millones de infectados, más de un millón de muertes anuales Ciclo complejo, transmitidos por vector invertebrado (mosquito Anopheles)

44 Proteasas de Plasmodium en la Digestión de la Hemoglobina
Se desarrolla en la vacuola alimenticia Consume el 75% de la Hb Se producen pequeños péptidos pero no AA por lo que existirían transportadores Las Plasmepsinas I - IV son aspártico proteasas implicadas en la primera fase de la digestión Las Falcipaínas I y II son cisteína proteasas que degradan los polipéptidos grandes generados La Falcilysina, una metaloproteasa de la familia M16, degrada los pequeños péptidos Una aminopeptidasa citosólica completaría el proceso produciendo AA libres

45 Plasmepsinas Nutrición
Degradación inicial de Hb nativa (plasmepsina I) Clivan enlace Leu203-His204 en región bisagra de cadena α

46 Plasmepsinas Invasión
Clivaje de espectrinas (CH3) del esqueleto de la membrana plasmática del GR

47 Amebiasis Infección intestinal o extraintestinal causada por Entamoeba histolytica 50 millones de infectados y 110 mil muertes anuales 2 especies reconocidas Entamoeba histolytica – patógena Entamoeba dispar – comensal (10% población mundial)

48 Cisteina Proteasas de Entamoeba histolytica y E. dispar

49 Proteasas en la Patogenia de la Amebiasis

50 Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de CP
Peptidil diazometanos basados en la secuencias LVG de las cistatinas , , epoxi ketonas - > potencia que E-64c Bis-arylacylhydrazidas y aril ureas-reversibles Mercaptoetilketonas, algunas con Ki de 1nM

51 Proteasas como Blancos Terapéuticos –Inhibidores de CP
La actividad de los inhibidores de CP contra T. Cruzi en cultivos o modelos animales correlaciona con la inhibición directa de la CP. No se pueden descartar otras acciones. En su mayoría los inhibidores también actúan sobre las catepsinas de mamíferos. Las células no se ven afectadas por las concentraciones que matan los parásitos. Redundancia?. Los parásitos resistentes a los inhibidores de CP no se mostraron resistente a drogas establecidas como nifurtimox indicando mecanismos diferentes