La descarga está en progreso. Por favor, espere

La descarga está en progreso. Por favor, espere

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS Y LIGNINA PEROXIDASAS DE HONGOS DEGRADADORES DE COLORANTES SELECCIONADOS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS.

Presentaciones similares


Presentación del tema: "DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS Y LIGNINA PEROXIDASAS DE HONGOS DEGRADADORES DE COLORANTES SELECCIONADOS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS."— Transcripción de la presentación:

1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS Y LIGNINA PEROXIDASAS DE HONGOS DEGRADADORES DE COLORANTES SELECCIONADOS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE LA INDUSTRIA TEXTIL Directora: M.C. Alma Koch Codirectora: Dra. Blanca Naranjo Tesista: Maritza Gardenia Páez Llerena

2 INTRODUCCIÓN Valenzuela, 2012 En el año 2005 la industria textil consumía litros de agua Diez mil colorantes y pigmentos Tratamientos: Físicos Químicos Biológicos: efectivos por la remoción de sustancias tóxicas Efluente industrial textil San Antonio de Pichincha

3 INTRODUCCIÓN Valenzuela, 2012 (ESPE) Manganeso Peroxidasas (MnP) Lignina Peroxidasas (LiP) Lacasas LACASAS: multicobre oxidasas (pH ) LIGNINA PEROXIDASAS: hemo-férrico (pH menor o igual 3)

4 OBJETIVOS Objetivo General: Determinar la actividad enzimática de lacasas y lignina peroxidasas de hongos degradadores de colorantes seleccionados para el tratamiento de aguas residuales de la industria textil. Objetivos Específicos: Determinar la actividad ligninolítica y celulolítica de los hongos seleccionados, mediante una prueba cualitativa con guaiacol y una prueba semi-cuantitativa con agar carboximetilcelulosa. Determinar la presencia de la enzima lacasa de los hongos degradadores de colorantes mediante una prueba cualitativa utilizando medio con ABTS. Evaluar la efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lacasas y lignina peroxidasas de los hongos. Cuantificar la actividad enzimática de lacasas utilizando dos sustratos, ABTS y O- toluidina. Cuantificar la actividad enzimática de lignina peroxidasas utilizando como sustrato ABTS.

5 DISEÑO Pruebas cualitativas y semi-cuantitativa (DCA) HONGOS (VARIABLE INDEPENDIENTE) VARIABLE DEPENDIENTE C20AL Prueba actividad ligninolítica: Crecimiento del hongo y cambio de color del medio Prueba de presencia de enzima lacasa: cambio coloración del medio Prueba actividad celulolítica: diámetro del halo de hidrólisis de celulosa C18BL C7AL C2BL C1BA Pruebas cuantitativas (Arreglo factorial) ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LIGNINA PEROXIDASAS 5x3x2=30 con 3 repeticiones5x3x1=15 con 3 repeticiones 5 hongos 3 medios naturales para la producción de enzimas 2 sustratos1 sustrato

6 Reactivación de las cepas AEM mg.L -1 cloranfenicol incubación una semana 28 o C / 80% HR PDB + clo incubación tres días a 30 o C / 100 r.p.m. Actividad ligninolítica con Guaiacol AEM con diferentes concentraciones de guaiacol. Incubación a 28 o C / 80% HR Actividad celulolítica en agar CMC CMC incubación 72 h / 28 o C. Luego 15 min 5 mL rojo congo 1% / 15 min 5 mL NaCl 2M. Refrigeración 12 h En medio sólido: Generación de Halos de decoloración Identificación macroscópica y microscópica frotis + KOH 0,1M micelio + azul de lactofenol Usanayo, 2007 Koduri & Ming, 2011 Gaitán y Pérez, 2007; Valencia, 2009 MATERIALES Y MÉTODOS En medio sólido: Crecimiento del hongo y cambio de coloración del medio

7 MATERIALES Y MÉTODOS Presencia de enzimas lacasas con ABTS siembra por disco en medio con ABTS / incubación 30 o C / 80% HR En medio sólido: Cambio de coloración del medio por oxidación del sustrato Córdoba, 2009 Evaluar la efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de enzimas sal y concentración / incubación 30 o C / 100 r.p.m / filtración Kahraman & Gurdal, 2001 Castillo, 2004 Coronel et al., 2001 Cuantificar la enzima lacasa utilizando dos sustratos ABTS y O-toluidina ABTS: 420 nm y O- toluidina: 627 nm Castillo, 2004 Cuantificar la enzima lignina peroxidasa con ABTS ABTS: 420 nm Castillo, 2004 Téllez, 2010

8 RESULTADOS Características macroscópicas de los hongos seleccionados HONGOS MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA DEL CRECIMIENTO FOTOGRAFÍA C1BA Género: Fusarium Blanco algodonoso. Reverso color rosado C18BL Género: Fusarium Blanco algodonoso, ciertos lugares color rosa-salmón. Parte posterior color rosa-salmón más tenue. Fotos Páez, 2011

9 RESULTADOS C2BL Género: Fusarium Blanco no tan algodonoso. Reverso color morado a rojizo. C7AL Género: Fusarium Blanco y morado no tan algodonoso. Reverso misma coloración que la parte delantera. C20AL Consorcio con dos hongos ambos del Género: Fusarium Blanco algodonoso. Reverso color morado claro.

10 RESULTADOS Características microscópicas de los hongos seleccionados HONGOSMORFOLOGÍA MICROSCÓPICA C1BA Género: Fusarium Conidias pequeñas. Hifas tabicadas. Clamidospora. C18BL Género: Fusarium Población integralmente de microconidias, muy pocas macroconidias. Hifas tabicadas. Conidióforo simple. C2BL Género: Fusarium Población rica en microconidias. Hifas tabicadas. Ausencia de conidióforos. C7AL Género: Fusarium Macroconidias grandes y pequeñas unicelulares. Ausencia clamidospora. Conidióforos unicelulares. Hifas tabicadas. Ocasionalmente formación de rizomorfos. C20AL Consorcio con dos hongos ambos del Género: Fusarium Consorcio con dos hongos del género Fusarium diferencia en el tamaño de esporas. Microconidas. Hifas tabicadas. Observación de clamidosporas con azul de lactofenol Foto Páez, 2011

11 RESULTADOS Actividad ligninolítica en medio con guaiacol Crecimiento del hongo y cambio de coloración del medio Visualización microscópica a 40x de los hongos Fotos Páez, 2011

12 Actividad ligninolítica en medio con guaiacol RESULTADOS Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos10,88952,17816,1410,000 Intra-grupos11,333840,135 Total22,22289 TRATAMIENTOSN Subconjunto para alfa = mL.L -1 sin aserrín150, mL.L -1 con aserrín150, mL.L -1 sin aserrín150, mL.L -1 con aserrín150, mL.L -1 sin aserrín151, mL.L -1 con aserrín151,0000 Sig.0,0630,1401,000 ANOVA DUNCAN

13 Actividad ligninolítica en medio con guaiacol RESULTADOS

14 Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa RESULTADOS Halo de hidrólisis de celulosa Fotos Páez, 2011

15 Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa RESULTADOS ANOVA TUKEY Y DUNCAN Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos3,53640,8844,2950,004 Intra-grupos11,320550,206 Total14,85659 HongoN Subconjunto para alfa = HSD de Tukey(a) C1BA122,6583 C20AL122,6750 C2BL122,8583 C7AL123,1833 C18BL123,2250 Sig.0,8160,0600,289 Duncan(a) C1BA 122,6583 C20AL122,6750 C2BL122,8583 C7AL123,1833 C18BL123,2250 Sig.0,3150,066

16 Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa RESULTADOS

17 Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS RESULTADOS Cambio de coloración del medio Fotos Páez, 2011

18 Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS RESULTADOS ANOVA Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos0,66740,1670,6250,655 Intra-grupos2,667100,267 Total3,33314 HongoN Subconjunto para alfa = HSD de Tukey(a) C7AL30,3333 C20AL30,6667 C18BL30,6667 C2BL30,6667 C1BA31,0000 Sig.0,539 Duncan(a) C7AL 30,3333 C20AL30,6667 C18BL30,6667 C2BL30,6667 C1BA31,0000 Sig.0,176 TUKEY Y DUNCAN

19 Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS RESULTADOS

20 RESULTADOS Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y O-toluidina Midió U durante 40 días del ensayo enzimático con mediciones cada 4 días Una unidad (U) de actividad de lacasas se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1 µmol de ABTS, por minuto, a pH=5 y a 30 o C. Una unidad (U) de actividad de lacasas se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1 µmol de O-toluidina, por minuto, a pH=3,7 y a 30 o C.

21 Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y O-toluidina RESULTADOS ANOVA DÍA 16 Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos799716, ,4473,6440,000 Intra-grupos454103, ,398 Total ,83189

22 Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y O-toluidina RESULTADOS DUNCAN

23 Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y O-toluidina RESULTADOS

24 RESULTADOS Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como sustrato el ABTS Midió U durante 40 días del ensayo enzimático con mediciones cada 4 días Una unidad (U) de actividad lignino peroxidásica se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1 µmol de ABTS, por minuto, a pH=3 y a 30 o C.

25 Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como sustrato el ABTS RESULTADOS ANOVA DÍA 16 DUNCAN Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos34849, ,22020,4460,000 Intra-grupos3652, ,748 Total38501,51244 Tratamiento N Subconjunto para alfa = ABTS.C18BL.M23102,513 ABTS.C20AL.M13102,513 ABTS.C7AL.M23105,820 ABTS.C2BL.M13119,047 ABTS.C20AL.M33121,252 ABTS.C2BL.M23123,456 ABTS.C7AL.M13124,559 ABTS.C18BL.M13132,275 ABTS.C2BL.M33134,479 ABTS.C20AL.M23136,684 ABTS.C18BL.M33139,991 ABTS.C7AL.M33141,093 ABTS.C1BA.M23167,548 ABTS.C1BA.M13168,650 ABTS.C1BA.M33210,537 Sig.0,071 0,0520,0660,9031,000

26 Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como sustrato el ABTS RESULTADOS

27 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de enzimas Actividad enzimática en dependencia del medio LACASAS LIGNINA PEROXIDASAS Fotos Páez, 2011

28 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lacasas ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS (U.L -1 enz) MEDIO DÍA M1 M2 M3119,45156,80114,85111,7683,9760,2269,7954,1552,478,95 ANOVA Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos304643, ,96938,0060,000 Intra-grupos348679, ,816 Total653323,89389

29 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lacasas MEDIO DE PRODUCCIÓN DE ENZIMAS NSubconjunto para alfa = HSD de Tukey(a) M23040,4321 M130104,5988 M330182,7160 Sig.1,000 Duncan(a)M23040,4321 M130104,5988 M330182,7160 Sig.1,000 TUKEY Y DUNCAN

30 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lacasas

31 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lignina peroxidasas ANOVA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA LIGNINO PEROXIDASICA (U.L -1 enz) MEDIO DÍA M1 150,57 M2 M376,7192,37 149,47137,78135,58125,88121,25114,8522,04 Suma de cuadrados gl Media cuadrática FSig. Inter-grupos13249, ,5411,5080,227 Intra-grupos382086, ,800 Total395335,66989

32 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lignina peroxidasas TUKEY Y DUNCAN MEDIO DE PRODUC CIÓN DE ENZIMAS N Subconjunto para alfa = HSD de Tukey(a) M230102,9541 M130121,3624 M330132,3649 Sig.0,204 Duncan(a) M230102,9541 M130121,3624 M330132,3649 Sig.0,108

33 RESULTADOS Efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lignina peroxidasas

34 CONCLUSIONES Los hongos estudiados pertenecen al género Fusarium. Los cinco hongos seleccionados presentaron actividad ligninolítica, identificados por el crecimiento y cambio de coloración del medio por oxidación del guaiacol. Los hongos estudiados presentaron actividad celulolítica (diámetro de halos de aclaramiento). C18BL presentó la mejor actividad, mientras que C1BA mostró la más baja. Los hongos expusieron presencia de lacasas en ABTS. C1BA expuso el mejor resultado y C7AL, el menor. El mejor tratamiento de actividad enzimática de lacasas fue ABTS.C1BA.M3, con 308,64 U.L -1 enz al día 16. El mejor tratamiento de cuantificación enzimática de lignina peroxidasas fue el ABTS.C1BA.M3, con 210,53 U.L -1 enz al día 16.

35 CONCLUSIONES La expresión enzimática de lacasas y de lignina peroxidasas alcanzó su valor óptimo al día 16 de 40 días de ensayo. Los hongos que presentaron menor actividad celulolítica son aquellos que más actividad enzimática de lacasas y lignina peroxidasas expusieron. El medio natural de producción de enzimas M3 fue el más favorable para la producción de lacasas y lignina peroxidasas.

36 RECOMENDACIONES Caracterizar los hongos por género y especie para optimizar condiciones de pH y temperatura. Optimizar pH y temperatura de los dos sustratos utilizados, para incrementar la producción de enzimas. Optimizar el medio de producción de enzimas con sales y producto ligninocelulósicos de afinidad para los hongos. Determinar la actividad enzimática de manganeso peroxidasas y aplicar el complejo enzimático ligninolítico para procesos de biorremediación. Aplicar a nivel de laboratorio el uso de enzimas ligninolíticas en la degradación de colorantes provenientes de la industria textil. Diseñar un biorreactor, a escala semi-industrial o industrial, para aplicar las propiedades fúngicas encontradas para la degradación de colorantes de la industria textil.

37 AGRADECIMIENTOS Agradezco a las autoridades de la ESPE que permitieron el desarrollo de esta tesis con el financiamiento Proyecto de Investigación 2010 ESPE-CEINCI 014 ¨SELECCIÓN DE HONGOS EFICIENTES EN LA BIODEGRADACIÓN DE MATERIA ORGÁNICA Y COLORANTES REACTIVOS, TOLERANTES A METALES, PARA SU USO EN BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE LA INDUSTRIA TEXTIL¨. e instalaciones prestadas.

38 AGRADECIMIENTOS A mi directora y codirectora de tesis M.C. Alma Koch y a la Dra. Blanca Naranjo por su constante apoyo, al Ing. Abraham Oleas por impartirme un poco de su extenso conocimiento. A la Ing. Erica Castillo y al Ing. Mauricio Moreno. A mis compañeros del laboratorio y amigos. A todos muchas GRACIAS!!! Y María Auxiliadora por todas las bendiciones recibidas y a mi familia por acompañarme durante toda mi carrera. GRACIAS!!!


Descargar ppt "DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS Y LIGNINA PEROXIDASAS DE HONGOS DEGRADADORES DE COLORANTES SELECCIONADOS PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS."

Presentaciones similares


Anuncios Google