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INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA EXTRACCION DE CAPSAICINOIDES M. C. Leonor Zavaleta Avejar Marzo, 2009.

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1 INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA EXTRACCION DE CAPSAICINOIDES M. C. Leonor Zavaleta Avejar Marzo, 2009

2 El chile es un aditivo popular en muchas partes del mundo, por su color, sabor aroma. En México representa una tradición e identidad cultural. El chile ha caracterizado la cocina y Cultura mexicana por los últimos ocho siglos. El chile es muy importante económicamente debido a su gran cantidad y amplia variedad. El consumo del chile se debe a su sabor picante. El sabor picante es causado por siete alcaloides o capsaicinoides, pero la capsaicina y dihidrocapsaicina son responsables del 90 % del sabor picante, éstos pertenecen al género Capsicum (Contreras y Yahia, 1998).

3 CAPSAICINOIDES Los capsaicinoides son alcaloides responsables del picor y ubicados principalmente en el tejido de la placenta adyacente a las semillas (De, 2003; Ben-Chaim et al., 2006). Su contenido depende del genotipo, la madurez del fruto y las condiciones de cultivo (Zewdie y Bosland, 2000). Los principales capsaicinoides son nornorcapsaicina, norcapsaicina, capsaicina, homocapsaicina, nornordihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina, dihidrocapsaicina, y homodihidrocapsaicina.. Los capsaicinoides en frutos maduros sólo se sintetizan en las células de la superficie de la placenta, los cuales se especializan como glándulas que segregan estos compuestos depositándolos en las semillas y paredes de la capa más interna de la pared frutal llamada endocarpio.

4 Placenta Las paredes que dividen el interior del fruto son incompletas y en el extremo inferior se unen para formar unas estructuras membranosas que comúnmente llamamos venas, las cuales se insertan en la placenta que es de color que es de color blanco amarillento y de apariencia esponjosa

5 El contenido de la capsaicina en diferentes frutos del chile fue reportado por Calus y Deb, (Balbaa y col, 1968), observando variaciones de 0.02 a %. Los niveles medidos dependieron de factores como la variación de la especie, origen geográfico de la muestra y condiciones climatológicas. Iwai y col. (1979), indicaron que el capsaicinoide fue detectado por primera vez 20 días después de floración y depende de las condiciones del cultivo como temperatura, período de exposición de luz y fertilización. Los mismos investigadores observaron que los niveles de capsaicinoides no sufren cambios apreciables en las etapas posteriores a la maduración y señalan que la capsaicina y la dihidrocapsaicina son los dos capsaicinoides principales en todas las etapas (García y Ortega, 1996).

6 La capsaicina tiene la siguiente fórmula condensada: C18H27O3N, con un peso molecular de g/g-mol. Forma cristales en forma de aguja, es inodora, con un punto de fusión de 64.5 º C y un punto de ebullición de 210 –220 º C. A una presión de 0.01 mm Hg, se sublima a 115 º C y presenta su máxima absorción en UV a 227 – 228 nm. Es soluble en éter etílico, alcohol etílico, acetona, alcohol metílico, tetracloruro de carbono, benceno y álcalis calientes. Es insoluble en agua fría (García y Ortega, 1996).

7 La dihidrocapsaicina tiene la siguiente fórmula condensa: C18H29O3N y un peso molecular de g/g-mol, forma cristales de color blanco opaco inodoro con una fuerte pungencia. Su punto de fusión varia entre 65.5 y 65.8 º C, presenta su máxima absorbencia en UV por debajo de 230 nm y sus propiedades de solubilidad son idénticas a las de la capsaicina (Susuki e Iwai, 1984).

8 EXTRACCIÓN DE CAPSAICINOIDES Debido a la característica de la polaridad de la molécula de capsaicinoides, para su extracción se emplean solventes polares de los cuales han dado buenos resultados: el alcohol metílico, el etílico y el isopropílico; la acetona, éter etílico y acetato de etilo. También hay otros solventes secundarios de positivos resultados, como son cloroformo, cloruro de metileno, hidróxido de sodio, agua tibia (Rymal y col, 1984; Suzuki y col, 1957; Suzuki e Iwai, 1984). El acetonitrilo da una eficiencia de extracción de capsaicinoides buena y reduce la cantidad de pigmentos y aceites presentes en la extracción con acetona (Thomas, 1998).

9 CUANTIFICACIÓN DE CAPSAICINOIDES La cuantificación de la capsaicina es una de la áreas que más han llamado la atención de los investigadores y probablemente la mitad de toda la información generada sobre los capsaicinoides está enfocada a su determinación analítica. Debido a esta inquietud se han desarrollado más de 150 procedimientos diferentes (García y Ortega, 1996). Entre la variedad de técnicas, las dos más importantes que se han desarrollado con base en la pungencia del chile son las técnicas sensoriales de Scoville y Guillete. Otras más consistentes son por colorimetría y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (García y Ortega, 1996). El contenido de capsaicinoides es medido en partes por millón (ppm). Estas, son convertidas a unidades Scoville, utilizando la siguiente formula: ppmH = Área del pico de capsaicina + (0.82 * Área del pico de dihidrocapsaicina) (ppm de estándar)(ml de acetonitrilo) (Área total del pico del estándar de capsaicina)(g de muestra) y el resultado se multiplica por 15 (Collins y col, 1995). Estas unidades son el estándar del nivel de pungencia utilizado en la industria del Capsicum (Hsonline, 2000; Margen y col, 1992).

10 La extracción de capsaicinoides de las muestras se realizó siguiendo el método de Collins y col (1995) reportado por Contreras y Yahia (1998). La extracción de capsaicinoides se hizo a los chiles frescos y secos en sus dos estados de madurez. En ambos casos la extracción se realizó por duplicado. En una balanza analítica con una sensibilidad de 0.1 mg, se pesó 3 g de muestra deshidratada o su equivalente cuando la muestra fue fresca, y se colocó en matraces de 250 ml. A cada matraz se le agregó 30 ml de acetonitrilo grado HPLC, los matraces se taparon con papel parafilm y aluminio (para evitar la evaporación del solvente) y se sometieron a calentamiento en un baño de agua (Haake SWB 20) a 78 °C, durante 4 horas con agitación constante. METODO DE EXTRACCION

11 Transcurrido el tiempo de calentamiento, se retiró la muestra del baño y se dejó enfriar a temperatura ambiente, una vez fría, se filtró a través de papel Whatman No. 4, y se guardó en tubos de ensaye forrados con papel aluminio, para evitar el contacto con la luz; el extracto se conservó en refrigeración a 4º C, hasta el momento de la cuantificación (Anexo I). Antes de realizar la cuantificación de capsaicinoides, el extracto obtenido se filtró en una membrana de nylon de 47 mm con tamaño de poro de 0.45 μm, dicha filtración se realizó con el fin de eliminar las partículas sólidas. Posteriormente para eliminar el color y partículas sólidas que aún pudiera tener se filtró en un cartucho Sep Pack C18 3 cc de 500 mg marca Waters y el filtrado se recibió en viales. En la cuantificación de los capsaicinoides, los viales se colocaron en el Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución (HPLC) Hewlett Packard serie 1100 con un detector de arreglo de diodos, columna fase reversa C18 X Terra de 4.6 mm x 250 mm y fase móvil metanol - agua en una relación de 73/27, a una longitud de onda de 280 nm.

12 El tiempo de corrida fue de 20 minutos a un flujo de 0.5 ml/min. Se programaron dos inyecciones de 20 μl por muestra. Para verificar los tiempos de retención de la capsaicina y dihidrocapsaicina se utilizaron estándares de estos compuestos marca Sigma con pureza de 98% y 90% respectivamente. Se realizó una curva de calibración para verificar la estabilidad del equipo y cuantificar los capsaicinoides de las muestras, se prepararon cinco concentraciones de cada estándar.

13 CUANTIFICACIÓN DE CAPSAICINOIDES Antes de trabajar con las líneas de chile bajo estudio, se realizaron pruebas preliminares de extracción y cuantificación de capsaicinoides utilizando chile habanero verde o inmaduro, así como al que se consideró en estado de madurez pleno, y con dos estados de procesamiento denominados, fresco y deshidratado con una humedad estimada de 6 - 8%. Este material fue obtenido de plantaciones comerciales promovidas por el Departamento de Promoción Rural de la Dirección de Desarrollo Social del Ayuntamiento de Mérida, Yucatán. Al método utilizado en la extracción de capsaicinoides se le ajustó la temperatura del baño, porque a 80 ºC, temperatura señalada por los autores mencionados, el solvente se evaporaba, esto representó un problema debido a que no se realizaba la extracción de los capsaicinoides, en cambio a 78 °C el solvente no se evaporaba y se realizó una buena extracción.

14 En el cuadro 1 se observan los resultados de la extracción y cuantificación de capasaicinoides. La concentración de estos aumenta después del proceso de secado. MuestraFrescoEstufaSolar Rojo 15,326.91( )127, a ( ) 114, a ( ) Naranja 11,683.28( )256, b ( ) 185, b ( ) Blanco 17,671.67( )170, b ( ) 173, b ( ) Amarillo51,760.65( )178, b ( )194, b ( 0) CUADRO 1. Unidades Scoville del chile habanero 40 DDF Valores en la misma fila seguidos de diferente letra indica diferencia significativa (P<0.05). Valores entre paréntesis indican la desviación estándar de la media

15 Los chiles maduros (Cuadro 2) al igual que los verdes, al someterlos al proceso de secado presentaron incremento del nivel de pungencia. En promedio, las muestras deshidratadas en estufa tuvieron mayor nivel de pungencia que aquellas deshidratadas en secador solar. La unidades Scoville de las muestras maduras fueron mayores que las muestras verdes, esto se atribuye a lo señalado por Contreras y Yahia (1998), que a los días después de la floración, el chile habanero alcanza el máximo nivel de capsaicinoides y después de ese tiempo decrece gradualmente (Iwai y col, 1979). MuestraFrescoEstufaSolar Rojo 20,614.01( )140, a ( )108, b ( ) Naranja 44,114.94( )175, b ( )191, b ( ) Blanco 32,293.46( )224, b ( )235, b ( ) Amarillo23,529.98( 0)237, b ( )223, b ( ) CUADRO 2. Unidades Scoville del chile habanero 54 DDF Valores en la misma fila seguidos de diferente letra indican diferencia significativa (P<0.05). Valores entre paréntesis indica la desviación estándar de la media

16 La variación del nivel de pungencia observada entre muestras se debe, como lo indica Iwai y col (1979), a las condiciones de cultivo como temperatura, periodo de exposición de luz y fertilización, de igual forma se atribuye a los factores indicados por Calus y Deb (Balbaa y col, 1968), tales como variación de la especie, origen geográfico o de la muestra. También el nivel de pungencia varia en chiles de la misma planta simplemente por diferencia en las condiciones de poscosecha (Thomas y col., 1998). Al realizar el análisis estadístico de las unidades Scoville, el factor muestra resultó significativo a un nivel de confianza de 95 %, es decir, las unidades Scoville dependen de la variedad del chile (rojo, naranja, amarillo y blanco).


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