Electroforesis de DNA.

Presentación del tema: "Electroforesis de DNA."— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis de DNA

2 DNA Topoisomerasas Izquierda Derecha

3 Enzimas de restricción
Clasificadas en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetria rotacional y generalmente requieren Mg2+ Secuencias palindrómicas Isosquisomeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde, algunas cortan sec blanco en diferentes posiciones. Sma I / Xma I Secuencias metiladas: A*: N6-metiladenina C*: 5-metilcitosina : Hpa II y Msp I Reconocen la secuencia CC*GG Hpa II: no digiere DNA metilado Msp I: Digiere met o no-metilado *90% de las metilaciones en genomas ocurren en 5.metilcitosina en C*G

4 Clonamiento de DNA

5 Desfosforilación de vectores
(para evitar asociación intramolecular)

6 68 kDa DNA Ligasa Actividad se mide en Unidase Weiss (Weiss, 1968)

7 Ligación de extremos cohesivos

8 Southern y Northern blot
Southern, E. M. (1975) J.Mol. Biol. 98, Southern y Northern blot

9 Southern blot

10 Generación de cDNA

11 Fabricación de replicas en Nitrocelulosa e hibridación in situ (en placa)
Screening: Rastreo, Escrutinio

12 Fago Lambda como vector de clonamiento

13 Clonamiento de DNA en plasmidos

14 DNA plasmidal PBR322

15 Clonamiento de DNA en plasmidos

16 Clonamiento de DNA en plasmidos

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19 Eliminación de fragmentos de Okazaki

20 (Reacción de Nick translation)
Eliminación de fragmentos de Okazaki (Reacción de Nick translation) + Mg2+ DNA pol I (E. coli) Holoenzima (monómerica) de 109 kDa. 5’  3’ Polimerasa 5’  3’ exonucleasa 3’  5’ exonucleasa Alternativamente: Marcaje por random Primer o incorporación en reacción de PCR

21 SINTESIS de DNA in vitro
Reacción de polimerización en cadena = polymerase chain reaccion (PCR) - Un fragmento de DNA (copia de una parte del DNA templado) - Múltiples copias (de una molécula templado  1 millon de copias) - DNA polimerasa (termoestable, de Termophilus aquaticus, Taq Pol) - Partidores, un par (los partidores dan la especificidad de la reacción) - dNTPs - Tampón (Mg2+, tampón)  30 ciclos de amplificacion: denaturacion 94ºC, 30seg apareamiento, 40-60ºC, 30seg extensión, 72ºC, 30seg ESPECIFICIDAD VELOCIDAD SENSIBILIDAD CONTROLES!

22 SINTESIS DE DNA in vitro PCR
- Iniciacion, elongacion, terminacion - in vitro INICIACION cuando y donde - multiples veces un fragmento de DNA - par de partidores sentido y antisentido secuencia especifica - DNA polimerasa termoestable TaqPol (Thermophylus aquaticus) ELONGACION ciclos de denaturacion, apareamiento, extension TERMINACION Extension final y guardar a 4ºC

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25 PCR Taq DNA pol (Thermus aquaticus) MW 65 kDa

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28 PCR de MICROSATELITES 5’ 3’ 5´ Partidor 1 Partidor 2
GATCGGATAACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGGTA 3’ MICROSATELITE 5’ CGACACTACCAGATG CACCTGATATCTGGTA TGTGTGTGTGTGTGTG Partidor 2 llllllllllllllll 5´ GCTGTGATGGTCTAC Partidor 1 lll GTGGACTATAGACCAT ACACACACACACACAC GCTGTGATGGTCTAC Marcadores genéticos: Identidad, medico legal, paternidad, etc

29 Análisis de microsatélites
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 pb 120 – 140 HTG4 170 – 188 HMS7 Análisis de microsatélites de caballos 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 pb 149 – 172 HMS3 218 – 238 HMS2 240 250 Sistema manual en geles de poliacrilamida modificada, Spreadex® en geles de 10 cm y tinción con bromuro de etidio.

30 R-Loops

31 Microscopía Electrónica, Tinción Negativa
R-Loops Microscopía Electrónica, Tinción Negativa Metodología alternativa: Ensayos de digestion con nucleasa S1, Degrada preferencialmente ssDNA o RNA. También para generar extremos romos y apertura del hairpin generado en la segunda hebra del cDNA

32 Replicación Viral: Circulo rodante y desplazamiento de hebra. (MET)
Tinción negativa

33 Denaturación y Renaturación del DNA
Construcción de bibliotecas de secuencias únicas

34 Denaturación del DNA e Hipercromicidad

35 Marcaje de DNA satélite en cromosomas
FISH

36 Separación de DNA por Ultracentrifugación

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38 Velocidad de Polimerización
Secuenciación de DNA (Sanger,1977) Enzima/ Propiedades Procesividad Velocidad de Polimerización Frag. Klenow (DNA pol I) 10-50 nt 45 nt/seg Sequenasa nt 300 nt/seg Taq DNA pol >7600 nt nt/seg Klenow: MW 76 kDa, carece de actividad 5’ 3’ exonucleasa por remoción proteolítica (Klenow, 1970). Sequenasa: DNA pol T7 modificada químicamente (sin activ. 3’  5’ exonucleasa)

39 Secuenciación de DNA (Sanger,1977)

40 Secuenciación Automatizada de DNA

41 AFLP DNA Fingerprinting AFLP RFLP RAPD DAF SSCP Microsatellite
Amplified Fragment polymorphism RFLP Restriction Fragment Length polymorphism RAPD Random Amplified polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting SSCP Single Strand Confirmational polymorphism Microsatellite

42 Análisis de Microarreglos de DNA

43 Microarreglos de DNA

44 Microarreglos de DNA Síntesis in situ y análisis in silico

45 Microarreglos de DNA

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47 Expresión Génica Temporal por microarreglos de DNA

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