INTRODUCCION RESULTADOS Mangado, A.,Novo, M.T.,Wapenaar, M.,Morales, P.,Quiros, M.,Salvadó, Z., Gonzalez, R. Departamento de genómica funcional aplicada.

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1 INTRODUCCION RESULTADOS Mangado, A.,Novo, M.T.,Wapenaar, M.,Morales, P.,Quiros, M.,Salvadó, Z., Gonzalez, R. Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica CSIC – Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino. CSIC-UR-GR. Edificio CCT. C/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Tfno. 941 29 9. ana.mangado@icvv.es MATERIAL Y METODOS EVALUACION FENOTIPICA Se realizaron ensayos de nefelometria en mosto para comprobar el crecimiento de la mutantes respecto a la wild type. Se eligieron 4 cepas y se determinó su tasa de crecimiento y la cinética inicial de ferementación. La perdida de CO2 se midió como perdida de peso cada 24 horas. El crecimiento celular se monitorizó a 600 nm en un lector de microplacas SPECTROstar Omega instrument (BMG Labtech, Offenburg, Germany). Para cada cepa se realizaron 8 repeticiones, para estudiar los parametros de crecimiento se utilizó la ecuación modificada de Gompertz propuesta por Zwietring et al (1990). Los datos experimentales se ajustaron a los modelos utilizando la regresión no lineal, usando spss 15.0. EVALUACION GENOTIPICA El DNA de cuatro cepas de las tres evoluciones dirigidas y el wild type fue secuenciado y comparado mediante alineamiento global. La extracción y purficación del DNA se realizo con un Kit DNeasy plant Minikit (Quiagen).La secuenciacion se realizó con por el método de terminadores reversibles con la plataforma Illumina de Solexa. A lo largo de su evolución, las levaduras enológicas han desarrollado mecanismos de adaptación a distintas condiciones ambientales de estrés, manteniendo su integridad celular y su actividad metabólica durante todo el proceso fermentativo. Pero la pregunta es como estos organismo alteran su genoma en respuesta a la presión selectiva de su medio ambiente. Dado que las condiciones ambientales, en concreto la composición del medio de cultivo, sufren importantes cambios a lo largo de la fermentación, éstas adaptaciones responden a diferentes factores y pueden ser distintas en función de la etapa del proceso que se considere. Cepas enológicas diferentes pueden mostrar rasgos adaptativos óptimos para diferentes momentos del proceso. Esto puede explicar en parte la sucesión de cepas de Saccharomyces cerevisiae que tiene lugar en las fermentaciones espontáneas de mosto de uva (Querol et al., 1992). La cepa de estudio es una cepa de laboratorio de la especie Saccharomyces cerevisiae derivada de S288C, BY4741. Esta levadura fué sometida a un cultivo continuo emulando las condiciones de la fase de crecimiento exponencial durante una vinificación. El cultivo contino se realizo a una D= 0,20 h-1 en un mosto sintético con un 20 % de azucares, suplementado para los requerimientos de la cepa. El ensayo se realizo por triplicado, llegando a obtenerse poblaciones de entre 150-230 generaciones. En cada uno de los procesos ha sido posible obtener varias cepas mejoradas respecto a la original en cuanto a su capacidad de crecimiento inicial en mosto modelo, tal como se ha determinado por su tasa de crecimiento y la cinética inicial de fermentación. Evolución dirigida de Saccharomyces cerevisiae en cultivo continuo para la adaptación a la primera fase de la fermentación alcohólica de mosto de uva. muestraN Subconjunto 121 Scheffe(a,b,c)BY 474180,1683 AV 880,2254 BV 198 0,2569 E188 0,2760 AV 168 0,2779 Significación 0,26140,3433 Querol, A., Barrio, E., Huerta, T., Ramón, D. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:2948-2953. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., & Van't Riet, K. 1990. Appl. Environ. Microbiol., 56(6), 1875-1881. Resultados preliminares indican que la adaptación a esta primera fase no supone, más bien al contrario, un acortamiento del tiempo total de fermentación (Fig 3). Siendo posiblemente una adaptación a solo las primeras horas, entendiendose esto como una mejora durante la fase exponencial, pero no durante el resto de la fermentación. Fig 3. Cinetica de fermentación de los mutantes seleccionados y del wild type. Fig 1. Nefelometria medida a lo largo de 24 horas para la cepa By4741 (wild type) y para 4 cepas evolucionas AV5, AV6, AV 7, AV 8. De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar, estas fueron analizadas por turbidometria en un nefelómetro para medir el crecimiento de estas respecto a la wild type. Se seleccionaron 4 cepas que se vieron mejoradas respecto a este en las primeras horas de crecimiento, como se puede ver en el ejemplo para la selección de una de las evoluciones,Fig 1 y para las cepas seleccionasdas Fig 2. CONCLUSIONES AGRADECIMIENTOS: Este trabajo ha sido financiado por el MICINN, proyecto AGL2009-07327. Fig 2. Nefelometria medida a lo largo de 24 horas para la cepa By4741 (wild type) y las 4 cepas seleccionadas para el estudio. Los datos obtenidos en el lector de microplacas fueron ajustados a un modelo primario de crecimiento mediante la ecuacion de Gompertz utilizando la regresión no lineal. Estos datos fueron analizados mediante un test ANOVA y comparados mediante el test de Scheffe Los valores de la asintota superior (A) no mostraban homogeneidad de varianzadas por lo que no fueron analizados. Tanto la tasa de crecimiento (mu= (lnx1-lnx0)/dt ), como la lag fueron significativos para un intervalo de confianza del 95% (P= 0.000 y P= 0.001 respectivamente). El test de comparaciones multiples reveló diferencias significativas entre la cepa wild type y tres de las cepas evolucionadas para la tasa de crecimiento y entre la wild type y una de las cepas evolucionadas para la fase lag. Tablas 1 y 2. Tablas 1y 2. Compraciones multiples mediante el test de Scheffe de los valores de µ y lag. muestraN Subconjunto 121 Scheffe(a,b,c)BV 1982,9206 BY 474183,2379 AV 883,4150 E1884,1253 AV 168 4,9575 Significación 0,20410,0546

2 INTRODUCCION RESULTADOS Mangado, A.,Novo, M.T.,Wapenaar, M.,Morales, P.,Quiros, M.,Salvadó, Z., Gonzalez, R. Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica Departamento de genómica funcional aplicada a la invest. enológica CSIC – Instituto de las Ciencias de la Vid y el Vino. CSIC-UR-GR. Edificio CCT. C/ Madre de Dios 51. 26006 Logroño. Tfno. 941 29 9. ana.mangado@icvv.es MATERIAL Y METODOS EVALUACION FENOTIPICA De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar. Se realizaron ensayos de nefelometria en mosto para comprobar el crecimiento de la mutantes respecto a la wild type. Se eligieron 4 cepas y se determinó su tasa de crecimiento y la cinética inicial de ferementación. La perdida de CO2 se midió como perdida de peso cada 24 horas. El crecimiento celular se monitorizó a 600 nm en un lector de microplacas SPECTROstar Omega instrument (BMG Labtech, Offenburg, Germany). Para cada cepa se realizaron 8 repeticiones; para estudiar los parametros de crecimiento se utilizó la ecuacion de Gompertz propuesta por Zwietring et al (1990). EVALUACION GENOTIPICA El DNA de cuatro cepas de las tres evoluciones dirigidas y el wild type fue secuenciado y comparado mediante alineamiento global. La extracción y purficación del DNA se realizo con un Kit DNeasy plant Minikit (Quiagen).La secuenciacion se realizó con por el método de terminadores reversibles con la plataforma Illumina de Solexa. A lo largo de su evolución, las levaduras enológicas han desarrollado mecanismos de adaptación a distintas condiciones ambientales de estrés, manteniendo su integridad celular y su actividad metabólica durante todo el proceso fermentativo. Pero la pregunta es como estos organismo alteran su genoma en respuesta a la presión selectiva de su medio ambiente. Dado que las condiciones ambientales, en concreto la composición del medio de cultivo, sufren importantes cambios a lo largo de la fermentación, éstas adaptaciones responden a diferentes factores y pueden ser distintas en función de la etapa del proceso que se considere. Cepas enológicas diferentes pueden mostrar rasgos adaptativos óptimos para diferentes momentos del proceso. Esto puede explicar en parte la sucesión de cepas de Saccharomyces cerevisiae que tiene lugar en las fermentaciones espontáneas de mosto de uva (Querol et al., 1992). La cepa de estudio es una cepa de laboratorio de la especie Saccharomyces cerevisiae derivada de S288C, BY4741. Esta levadura fué sometida a un cultivo continuo emulando las condiciones de la fase de crecimiento exponencial durante una vinificación. El cultivo contino se realizo a una D= 0,20 h-1 en un mosto sintético con un 20 % de azucares, suplementado para los requerimientos de la cepa. El ensayo se realizo por triplicado, llegando a obtenerse poblaciones de entre 150-230 generaciones. En cada uno de los procesos ha sido posible obtener varias cepas mejoradas respecto a la original en cuanto a su capacidad de crecimiento inicial en mosto modelo, tal como se ha determinado por su tasa de crecimiento y la cinética inicial de fermentación. Evolución dirigida de Saccharomyces cerevisiae en cultivo continuo para la adaptación a la primera fase de la fermentación alcohólica de mosto de uva. muestraN Subconjunto 121 Scheffe(a,b,c)BY 474180,1683 AV 880,2254 BV 198 0,2569 E188 0,2760 AV 168 0,2779 Significación 0,26140,3433 Fig 2. Perfiles fermetativos Fig 1. Nefelometria Resultados preliminares indican que la adaptación a esta primera fase no supone, más bien al contrario, un acortamiento del tiempo total de fermentación (Fig 2). Siendo posiblemente una adaptación a solo las primeras horas, entendiendose esto como una mejora durante la fase exponencial, pero no durante el resto de la fermentación. Los datos obtenidos en el lector de microplacas fueron ajustados a un modelo primario de crecimiento mediante la ecuacion de Gompertz utilizando la regresión no lineal. Estos datos fueron analizados mediante un test ANOVA y comparados mediante el test de Scheffe Los valores de la asintota superior (A) no mostraban homogeneidad de varianzadas por lo que no fueron analizados. Tanto la tasa de crecimiento (mu= (lnx1-lnx0)/dt ), como la lag fueron significativos para un intervalo de confianza del 95% (P= 0.000 y P= 0.001 respectivamente). El test de comparaciones multiples reveló diferencias significativas entre la cepa wild type y tres de las cepas evolucionadas para la tasa de crecimiento y entre la wild type y una de las cepas evolucionadas para la fase lag. Tablas 1 y 2. CONCLUSIONES De cada evolución se eligieron 36 cepas al azar, estas fueron analizadas por turbidometria en un nefelómetro para medir el crecimiento de estas respecto a la wild type. Se seleccionaron 4 cepas que se vieron mejoradas respecto a este en las primeras horas de crecimiento, como se puede ver en el ejemplo para la selección de una de las evoluciones,Fig 1 y para las cepas seleccionasdas Fig 2. Tablas 1y 2. Compraciones multiples mediante el test de Scheffe de los valores de µ y lag. muestraN Subconjunto 121 Scheffe(a,b,c)BV 1982,9206 BY 474183,2379 AV 883,4150 E1884,1253 AV 168 4,9575 Significación 0,20410,0546 Querol, A., Barrio, E., Huerta, T., Ramón, D. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58:2948-2953. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., & Van't Riet, K. 1990. Appl. Environ. Microbiol., 56(6), 1875-1881. AGRADECIMIENTOS: Este trabajo ha sido financiado por el MICINN, proyecto AGL2009-07327.