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CONCEPTO DE HEMOSTASIA Proceso complejo que permite: Prevenir de forma contínua la pérdida espontánea de sangre Detener la hemorragia causada por daños.

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1 CONCEPTO DE HEMOSTASIA Proceso complejo que permite: Prevenir de forma contínua la pérdida espontánea de sangre Detener la hemorragia causada por daños al Sistema Vascular

2 FASES DE LA HEMOSTASIA Hemostasia primaria: Fase de vasoconstricción parietal: Liberación de factores tisulares de coagulación Fase endotelial-trombocitaria: Activación de plaquetas Resultado: Formación de un tapón inestable de plaquetas (3-5 min)

3 Proceso Hemostático Vasoconstricción localizada Vasoconstricción localizada Adhesión plaquetaria Adhesión plaquetaria Agregación plaquetaria Agregación plaquetaria Formación de la malla de Fibrina Formación de la malla de Fibrina Activación del Mecanismo Fibrinolítico Activación del Mecanismo Fibrinolítico Hemostasia 1ª Hemostasia 2ª Fibrinólisis

4 Coagulación: Fase de formación de trombina: Cascada de activación de enzimas y factores Fase de formación de fibrina: Producción de una red insoluble de proteína Resultado: Estabilización y fijación del coágulo (5-10 min) FASES DE LA HEMOSTASIA

5 Fibrinolisis: Cicatrización del tejido vascular lesionado Destrucción enzimática de la red de fibrina Resultado: Situación hemostática normal (48-72 horas) FASES DE LA HEMOSTASIA

6 HEMOSTASIA Lesión Endotelial Vasoconstricción refleja Serotonina Colágeno Plaquetas Adhesión Liberación P. Plasma Coagulación intrínseca F III Coagulación extrínseca ADP Agregación Reversible Agregación Irreversible Trombina FIBRINOGENO COAGULO DE FIBRINA Fgto. Fibrina Fibrinolisis TROMBO PLAQUETARIO

7 RESPUESTA PLAQUETARIA A LA INJURIA VASCULAR

8 ENDOTELIO VASCULAR MONOCAPA DE CÉLULAS ENDOTELIALES QUE REVISTE LA SUPERFICIE INTERNA DE LOS VASOS SANGUÍNEOS. MONOCAPA DE CÉLULAS ENDOTELIALES QUE REVISTE LA SUPERFICIE INTERNA DE LOS VASOS SANGUÍNEOS. Variable según su ubicación Variable según su ubicación La integridad del endotelio permite mantener una superficie antitrombótica y anticoagulante. La integridad del endotelio permite mantener una superficie antitrombótica y anticoagulante.

9 PARED VASCULAR: Capas v Célula endotelial: el endotelio es un órgano activo que participa en la regulación de la hemostasia, del tono y de la permeabilidad vascular. Interviene en la proliferación e inmunidad celulares. v Subendotelio: l membrana basal l elastina l microfibrillas l fibras de colágeno l proteoglicanos l fibronectina l glicosamiglicanos l pocas células musculares lisas v Lámina elástica interna

10 SUSTANCIAS LIBERADAS POR CE Vasoactivas Vasoactivas Estimuladoras/Inhibidoras del crecimiento celular Estimuladoras/Inhibidoras del crecimiento celular Moléculas de adhesión celular Moléculas de adhesión celular Citoquinas proaterogénicas/antiaterogénicas Citoquinas proaterogénicas/antiaterogénicas Factores procoagulantes/anticoagulantes Factores procoagulantes/anticoagulantes

11 FUNCIONES DEL ENDOTELIO Regulación de la proliferación de las células musculares lisas vasculares Regulación de la proliferación de las células musculares lisas vasculares Síntesis de sustancias reguladoras del sistema inmune y del mecanismo de inflamación Síntesis de sustancias reguladoras del sistema inmune y del mecanismo de inflamación Modula la oxidación lipídica Modula la oxidación lipídica Capacidad para autorregenerarse Capacidad para autorregenerarse

12 SUSTANCIAS VASOACTIVAS Vasodilatadora Óxido Nítrico Óxido Nítrico Prostaciclina Prostaciclina Bradiquinina Bradiquinina Serotonina Serotonina Histamina Histamina Vasoconstrictora Endotelina Endotelina Angiotensina II Angiotensina II Tromboxano A2 Tromboxano A2 Prostaglandina Prostaglandina Ácido Araquidónico Ácido Araquidónico

13 Interacción Endotelio - Plaqueta

14 CÉLULA ENDOTELIAL VASCULAR (Vasos grandes) NO PGI2 PGE2 t-PA INHIBICIÓN ACTIVACIÓN PLAQUETAS Y LEUCOCITOS INHIBICIÓN ACTIVACIÓN PLAQUETAS Y LEUCOCITOS INHIBICIÓN TROMBOSIS INHIBICIÓN TROMBOSIS TROMBOLISIS TROMBOLISIS MANTENIMIENTO DE PERFUSIÓN TISULAR MANTENIMIENTO DE PERFUSIÓN TISULAR PROTECCIÓN DE PAREDES VASCULARES Y UNIONES ENDOTELIALES PROTECCIÓN DE PAREDES VASCULARES Y UNIONES ENDOTELIALES

15 FACTORES HEMOSTÁTICOS Procoagulantes Procoagulantes Factor von Willebrand Factor von Willebrand Factor tisular Factor tisular PAF PAF PAI-1 PAI-1 Metaloproteasas Metaloproteasas Receptores de trombina Receptores de trombina Anticoagulantes Anticoagulantes PGI 2 PGI 2 t-PA t-PA u-PA u-PA Trombomodulina Trombomodulina GAGS GAGS

16 ENDOTELIO NORMAL 1.- BARRERA DE PERMEABILIDAD ALTAMENTE SELECTIVA. contiene receptores para LDL contiene receptores para LDL 2.- SUPERFICIE NO TROMBOGÉNICA secreta PGI2 secreta PGI2 secreta PLASMINÓGENO secreta PLASMINÓGENO contiene GAGS contiene GAGS

17 3.- SECRECIÓN DE vWF (necesario para la adhesión de plaquetas a la pared vascular) (necesario para la adhesión de plaquetas a la pared vascular) 4.-PRODUCCIÓN DE ÓXIDO NÍTRICO 5.- LIBERACIÓN DE ENDOTELINAS (expresa en la membrana la enzima conversora de Angiotensina I y II) (expresa en la membrana la enzima conversora de Angiotensina I y II) 6.- INTERACCIÓN CON PLAQUETAS, MONOCITOS, MACROFAGOS, LINFOCITOS Y CÉLULAS DE MUSCULO LISO (mediante citoquinas y factores de crecimiento) (mediante citoquinas y factores de crecimiento)

18 Endotelio: Modulador de la Trombogenicidad

19 ESQUEMA DEL MECANISMO HEMOSTATICO ( I) VASO SANGUÍNEO INTACTO (endotelio presente) VASO SANGUÍNEO INTACTO (endotelio presente) - Función endotelial normal (superficie vascular tromborresistente) Vasodilatadores (NO)Vasodilatadores (NO) Antigregantes (prostaciclina)Antigregantes (prostaciclina) Anticoagulantes (trombomodulina, heparina)Anticoagulantes (trombomodulina, heparina) Fibrinolíticos (activador del plasminógeno –tPA-)Fibrinolíticos (activador del plasminógeno –tPA-) - Ausencia de activación de las plaquetas y la coagulación. - No se expresan moléculas de adhesión de leucocitos.

20 ESQUEMA DEL MECANISMO HEMOSTATICO (I) Vaso sanguíneo lesionado (superficie vascular tromborresistente alterada) Vaso sanguíneo lesionado (superficie vascular tromborresistente alterada) 1. Endotelio presente pero con función anormal 1. Endotelio presente pero con función anormal Predominio de sustancias tromboactivas. Predominio de sustancias tromboactivas. - Vasoconstrictores (endotelina, noradrenalina) - Procoagulantes (factor VIII-vW, factor tisular) - Antifibrinolíticos (inhibidor de tPA) Además se expresan moléculas de adhesión. Además se expresan moléculas de adhesión. Hay producción de antihemostáticos y vasodilatadores. Hay producción de antihemostáticos y vasodilatadores.

21 ÓXIDO NÍTRICO vasodilatación. vasodilatación. inhibición de angiotensina II y de la vasoconstricción simpática. inhibición de angiotensina II y de la vasoconstricción simpática. inhibición de la adhesión plaquetaria al endotelio vascular. inhibición de la adhesión plaquetaria al endotelio vascular. antiproliferativo, inhibe hiperplasia de las células de músculo liso luego de injuria vascular. antiproliferativo, inhibe hiperplasia de las células de músculo liso luego de injuria vascular. elimina al anión superóxido (anti-inflamatorio). elimina al anión superóxido (anti-inflamatorio).

22 Endotelio: Modulador del Tono vascular

23 11-DH-TXB 2 8-epi-PGF 2 2,3-dinor-6-oxo-PGF 1 Orina 2 GPI Fosfolípidos AA Ac. araquid Y 8-epi-PGF 2 Y Y CélulasapoptóticasCélulasapoptóticas Monocitos Células endoteliales Y Y Citoquinas Cox1 Cox2 AA PGI 2 Y Y Neutrófilos Y Y Fc R VCAM 8-epi-PGF 2 Radicales libres Y ICAM E-selectina AA TXA 2 Cox1 Plaquetas Y Y Y FR Forastiero et al, Sangre 1999

24 CINETICA PLAQUETARIA Del total de plaquetas del cuerpo, 2/3 circula por la sangre y el otro 1/3 se deposita en el bazo. Del total de plaquetas del cuerpo, 2/3 circula por la sangre y el otro 1/3 se deposita en el bazo. Hay intercambio entre las plaquetas sanguíneas y las esplénicas. Hay intercambio entre las plaquetas sanguíneas y las esplénicas. Hay unas /mm 3. Hay unas /mm 3. Su vida media es entre 8 y 12 días. Su vida media es entre 8 y 12 días. Se destruyen en el hígado y en el bazo, por el SMF. Se destruyen en el hígado y en el bazo, por el SMF.

25 TROMBOPOYESIS TROMBOPOYETINA STEM CELL TROMBOPOYETICA CFU mega 1 Meg CSF CFU mega 2 PROMEGACARIOBLASTO MEGACARIOBLASTO PROMEGACARIOCITO MEGACARIOCITO PLAQUETAS

26 Trombopoyesis Megacarioblasto

27 Promegacariocito

28 Megacariocito

29 ESTRUCTURA DE LAS PLAQUETAS Discos biconvexos 3-4 mm de diámetro mayor por mm de diámetro menor Aspecto liso con aberturas de canales intraplaquetarios

30 Plaquetas: - pequeñas células anucleadas (diámetro 2 m, volúmen 7-9 fl). - concentración promedio x 10 9 / l. - derivan de la fragmentación de los megacariocitos de médula osea. Circulan en condiciones de reposo con apariencia de una lenteja. La integridad funcional del endotelio asegura el estado de reposo gracias a la producción de PGI 2 y NO.

31 MK INMADURO 1-AMPLIFICACION 2-SINT. ORGANELAS 3-SINTESIS. PROT PLAQUETARIAS 4-REORDENAMIENTO MICROTUBULOS 5-FORMACION DE PROPLAQUETAS 6-TRANSPORTE DE ORGANELAS 7-AMPLIFICACION FINAL 8-LIBERACION DE PRO- PLAQUETAS 9-PLAQUETAS 10-APOPTOSIS MK FORMACION DE PLAQUETAS

32

33 A-Membrana Plaquetaria / intra y extra celular. B-Gránulos y organelas intracitoplasmáticas / secreción plaquetaria C-Cito esqueleto / proteínas motoras. ESTRUCTURA

34 MICROTUBULOS mitocondrias L STD SCA GLICOG GP IIb-IIIaGP Ib-IX-V MP IIHEMA-ANM ESTRUCTURA

35 ESTRUCTURA DE LA PLAQUETA

36 ESTRUCTURA

37 CITOESQUELETO MICROTUBULOS TUBULINA Quinesina y Dineína MALLA DE ACTINA Monomero Globulares Filamentos (G-Actina) (F-Actina) Filamina A (ABP-280), talina, K-actina, miosina I y II

38 CITOESQUELETO

39 PLAQUETAS Membrana Celular Membrana Celular Glicoproteínas, factor plaquetar 3, ácido sialico, fosfolípidos, colesterol y lípidos neutros. Glicoproteínas, factor plaquetar 3, ácido sialico, fosfolípidos, colesterol y lípidos neutros. No se adhiere al endotelio normal, pero si al lesionado o al colágeno subendotelial. No se adhiere al endotelio normal, pero si al lesionado o al colágeno subendotelial.Citoplasma Gránulos densos: Serotonina, ADP, Catecolaminas, Ca ++ Gránulos densos: Serotonina, ADP, Catecolaminas, Ca ++ Gránulosα: Factores de coagulación, PDGF. Gránulosα: Factores de coagulación, PDGF. El contenido de los gránulos se secreta en plaquetas activadas durante la reacción de LIBERACIÓN. En ella, la plaqueta se contrae gracias 1.- Actina y miosina. 2.- Trombastenina. 3.- Residuos Rer y aparato de Golgi (almacén Ca ++ ) 4.- Mitocondrias ATP y ADP

40 MEMBRANA PLASMATICA Rol fundamental: - mantenimiento de la integridad citoplasmática. - como mediador de las interacciones con proteínas vasculares y plasmáticas. - como mediador de las interacciones intracelulares con los elementos del citoesqueleto. Fosfolípidos: distribución asimétrica, fosfolípidos neutros en la capa externa y los aniónicos en la interna. Limita la superficie plaquetaria extendiendo hacia adentro múltiples canales que dan origen al sistema canalicular conectado a superficie.

41 MEMBRANA PLASMATICA Glicoproteínas de membrana: -GP Ib-IX-V -GP IIb-IIIa (pool externo) -GP VI -GP Ia-IIa Receptores de activación: - de ADP - deTrombina - deTromboxano A 2 - de Adrenalina GP Ib-V-IX (vWF) GP Ia IIa GP VI Colágeno GP IIb IIIa (Fibrinógeno y vWF) Proteínas de 7 dominios de trans-membrana asociadas a proteína G Receptores de activación

42 GRANULOS PLAQUETARIOS L Fg, FV, FP4, vWF, Fn, Tr, Alb, Tp, PDGF ADP, ATP, Serot, Ca 2+ Enzimas Hidroliticas

43 GRANULOS PLAQUETARIOS: centralización durante la activación

44 ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS PLAQUETAS 1. RELACION ESTRUCTURA-FUNCION: MEMBRANA PLAQUETARIA: INTERACCION CON EL EXTERIOR (RECEPTORES) Interacciones con ligandos en la lámina basal del endotelio lesionado Transducción de señales de ligandos circulantes Interacción con otras células de la sangre CITOESQUELETO: CAMBIO DE FORMA Y SECRECION Contracción celular Secreción del contenido de gránulos específicos GRANULOS ESPECIFICOS: ALMACEN DE PRODUCTOS ACTIVOS Moléculas pro-hemostáticas Moléculas pro-cicatrizantes Moléculas activadoras de plaquetas

45 GLICOPROTEINAS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA 1. FUNCIONES GENERALES: Mediadores de los procesos de adhesión y agregación Receptores para ligandos extracelulares Participación en reconocimiento y fagocitosis Unión de proteínas del complemento Identidad antigénica Mediación de procesos de transporte de membrana Función como enzimas o como antiproteasas Estabilización de la membrana Contribución a la carga de superficie

46 Glucoproteina Familia gènica LigandoFunciòn GPIIb/IIIaIntegrina Fg, vWF,FN,VN Agregaciòn,adhesiòn Receptor de VitronectinaIntegrina VN, Fg,vWF Adhesiòn GPIc/IIaIntegrinaFN,lamininaAdhesiòn GPIa/IIaIntegrinaColàgenoAdhesiòn GPIb/IX GP rica en leucina vWF,TrombinaAdhesiòn Selectina P SelectinaPSGL-1 Interacciòn Plq-GB PECAM-1Ig Interacciòn Plq-Cel GPIVTSP,ColagenoAdhesiòn

47 GP IIb-IIIa - pertenece a la familia de las integrinas - es la GP más abundante copias - existe un pool intracelular en las membranas internas - en el estado activo tiene dos sitios de unión para fibrinógeno, también une vWF y fibronectina - la unión a estos ligandos genera una activación adicional de la plaqueta (activación outside-in)

48 Interacción plaqueta-plaqueta. GP IIb-IIIa mediadora de estas interacciones. - Extensión: cohesión y secreción GP IIb-IIIa pasa de una conformación de baja a una de alta afinidad, como resultado de de los efecto de los agonistas sobre la plaqueta. Ligandos: fibrinógeno,vonWillebrand Fibronectina, vitronectina

49 INTEGRINAS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA gp Ib: Forma complejos en la membrana plaquetaria con gpIX y citoesqueleto Receptor de contacto con la lámina basal endotelial: factor Von Willebrand Posible receptor de la trombina Es deficiente en los pacientes con Síndrome de Bernard-Soulier gpIa: Receptor de colágeno y fibronectina Complejo gpIIb/IIIa: Su formación es dependiente de Ca 2+ Receptor de fibrinógeno, factor Von Willebrand, fibronectina Implicado en la unión plaqueta-plaqueta en la agregación Diana de tratamientos antiplaquetarios Es deficiente en pacientes con Tromboastenia de Glanzmann gp IV: Posible receptor de colágeno y trombospondina

50 FUNCION PLAQUETARIA: RECEPTORES DE MEMBRANA

51 RECEPTORES NO GLICOPROTEICOS DE LA MEMBRANA PLAQUETARIA 1. CLASIFICACION FUNCIONAL: Receptores activadores: ADP, Adrenalina, Colágeno, Serotonina, Trombina, Tromboxano A2 Receptores inhibidores: Prostaglandinas I2 y E1, Prostaglandina D2, Adenosina 2. PAPEL DE LOS LIGANDOS DE RECEPTORES: ADP: Su unión induce la expresión de gpIIb/IIIa Induce la agregación a través de fibrinógeno Inhibe la adenil ciclasa Adrenalina (receptores adrenérgicos): Induce agregación sin cambio de forma Potencia la acción de otros agonistas Tromboxano A2: Induce la movilización de Ca 2+ intracelular Potencia la acción de otros agonistas Prostaglandinas: Inducen la activación de adenil ciclasa El AMPc aumentado inhibe la activación de plaquetas

52 Adenyl cyclase Agregación Shape change PLC GqGq GiGi Ca 2+ ? P 2Y1 ADP Tienopiridines P 2TAC P 2X1 RECEPTOR DE ADP

53 Sos Grb2 Sos Grb2 Thrombin Fibrinogen FAK PYK2 PLC PI3K Integrin Activation DG IP3 PKC (Tyr kinase) Ca 2+ PYK2 PI3K Src? Syk Vav Rac Grb2 Sos Grb2 Sos Ras Raf MEK ERK1 ERK2 Rho Adhesion and Aggregation ? ? ? Adenyl cyclase - ATP AMPc Thrombin receptor Integrin IIb 3 RECEPTOR DE TROMBINA

54 FUNCIONES DE LAS PLAQUETAS Formación del trombo blanco plaquetario. Formación del trombo blanco plaquetario. Adhesión Adhesión Activación Activación Cambios morfológicos Cambios morfológicos Alteraciones de la membranaAlteraciones de la membrana Estimulación de la síntesisEstimulación de la síntesis DesgranulaciónDesgranulación Agregación Agregación Almacenamiento y producción de factores. Almacenamiento y producción de factores. f1p; f2p; f3p; f4p; fibrinógeno; von Willebrand; FV; FXIII; trombostenina. f1p; f2p; f3p; f4p; fibrinógeno; von Willebrand; FV; FXIII; trombostenina.

55 FORMACIÓN DEL TROMBO BLANCO El proceso se desarrolla en tres fases, con interacción de las plaquetas con la pared del vaso (adhesión), la activación de las mismas y la interacción de las plaquetas entre si (agregación). El proceso se desarrolla en tres fases, con interacción de las plaquetas con la pared del vaso (adhesión), la activación de las mismas y la interacción de las plaquetas entre si (agregación).

56 ADHESIÓN DE LAS PLAQUETAS Tras la sección de un vaso las primeras plaquetas que escapan se adhieren a las fibras de colageno, a las microfibrillas y al subendotelio. Tras la sección de un vaso las primeras plaquetas que escapan se adhieren a las fibras de colageno, a las microfibrillas y al subendotelio. Es rápida (1-2 sg) e irreversible. Es rápida (1-2 sg) e irreversible. Este contacto produce la liberación de ADP y con ello la activación de las plaquetas. Este contacto produce la liberación de ADP y con ello la activación de las plaquetas.

57 ADHESIÒN PLAQUETARIA

58 ACTIVACIÓN DE LAS PLAQUETAS Cambios morfológicos: tiene lugar la metamorfosis viscosa, con transformación de la forma de disco y aumento de seudópodos. Cambios morfológicos: tiene lugar la metamorfosis viscosa, con transformación de la forma de disco y aumento de seudópodos. Alteraciones de membrana: formación de receptores que aumenta la agregación. Alteraciones de membrana: formación de receptores que aumenta la agregación. Estimulación de la síntesis. Estimulación de la síntesis. Desgranulación y liberación de sustancias. Desgranulación y liberación de sustancias.

59 PLAQUETAS cambios morfológicos por activación microtúbulos 1 m microfilamentos gránulos

60 AGREGACIÓN DE LAS PLAQUETAS Es un entramado de plaquetas entre si. Es un entramado de plaquetas entre si. Este agregado plaquetario es lo que se conoce como trombo blanco. Este agregado plaquetario es lo que se conoce como trombo blanco. El trombo blanco es inestable y reversible. El trombo blanco es inestable y reversible. Para que sea irreversible debe contraerse mediante la trombostenina plaquetaria. Para que sea irreversible debe contraerse mediante la trombostenina plaquetaria.

61 CAMBIO DE FORMA

62 AGREGACIÒN PLAQUETARIA

63 …SE FORMA UNA MONOCAPA Iniciación

64 ADP Thromboxane A 2 ADP y otros activadores son liberados Generación de TXA2 Liberación de Agonistas

65 …y se incrementa la agregación. Amplificación de la activación Plaquetaria Se acelera la activación …

66 AGREGACIÒN Formación del agregado plaquetario

67 - Iniciación: captura, adhesión, activación

68 Interacción con matriz sub-endotelial Interacción entre vWF y IIb-IIIa permitirá unión estable al sub-endotelio

69 Interacción con matriz sub-endotelial copias por plaqueta -receptor del vWf -alta afinidad por el vWf en la plaqueta en estado de reposo -la unión a vWf induce activación plaquetaria -es endocitada cuando la plaqueta se activa

70 - Iniciación: captura, adhesión, activación

71 - Extensión: cohesión y secreción

72 - Perpetuación: estabilización del trombo

73

74 Mecanismos de amplificación de activación inicial: agonistas solubles y receptores de siete dominios de transmembrana asociados a proteína G.

75 ACTIVACIÒN PLAQUETARIA Se inicia en la superficie de la cèlula, mediante la interacciòn de un Agonista con su Receptor (GP) Se inicia en la superficie de la cèlula, mediante la interacciòn de un Agonista con su Receptor (GP) Para la interacciòn entre los Receptores de superficie y los Efectores intracelulares ( Adenilciclasa Y Fosfolipasas A2 y C) Se necesitan las Proteinas Reguladoras (Proteinas Gs y Gi) Para la interacciòn entre los Receptores de superficie y los Efectores intracelulares ( Adenilciclasa Y Fosfolipasas A2 y C) Se necesitan las Proteinas Reguladoras (Proteinas Gs y Gi) Los agentes que aumentan el AMPc (PGI2 y PGE1) lo hacen a traves de la Gs Los agentes que aumentan el AMPc (PGI2 y PGE1) lo hacen a traves de la Gs Los agonistas que inhiben el AMPc ( Trombina y Adrenalina) lo hacen a traves de las Gi Los agonistas que inhiben el AMPc ( Trombina y Adrenalina) lo hacen a traves de las Gi La transducciòn de la señal se realiza atraves de 2º mensajeros. Dos vias intracelulares estan implicadas en la activaciòn : La via de los Fosfoinositoles y la via del A.Araquidònico La transducciòn de la señal se realiza atraves de 2º mensajeros. Dos vias intracelulares estan implicadas en la activaciòn : La via de los Fosfoinositoles y la via del A.Araquidònico

76 Woulfe DS, 2005

77 ACTIVACIÒN -MENSAJEROS INTRACELULARES La uniòn de agonistas a sus receptores de transmenbrana desencadena el metabolismo del fosfatidil inositol a traves dela activaciòn,dependiente de proteina G, de la fosfolipasaC que hidroliza al fosfatidilinositol generando IP3 Y DG que activa la PKC La uniòn de agonistas a sus receptores de transmenbrana desencadena el metabolismo del fosfatidil inositol a traves dela activaciòn,dependiente de proteina G, de la fosfolipasaC que hidroliza al fosfatidilinositol generando IP3 Y DG que activa la PKC

78 EFECTORES INTRACELULARES La concentraciòn de Ca2+ :aumenta por acciòn de IP3 y disminuye por aumento de AMPc La concentraciòn de Ca2+ :aumenta por acciòn de IP3 y disminuye por aumento de AMPc El aumento de Ca 2+genera la activaciòn de la PKC y activa la fosfolipasa A El aumento de Ca 2+genera la activaciòn de la PKC y activa la fosfolipasa A El DG activa la PKC,promoviendo su traslado del citoplasma a la membrana y aumentando su afinidad por el Ca2+.Esta kinasa cataliza la fosforilacion de residuos de serina y treonina de varias proteinas implicadas en la secreciòn de grànulos a y en la exposiciòn del sitio receptor para el Fg en el complejoGPIIb/IIIa El DG activa la PKC,promoviendo su traslado del citoplasma a la membrana y aumentando su afinidad por el Ca2+.Esta kinasa cataliza la fosforilacion de residuos de serina y treonina de varias proteinas implicadas en la secreciòn de grànulos a y en la exposiciòn del sitio receptor para el Fg en el complejoGPIIb/IIIa La activaciòn de la PKCes esencial par que ocurra la agregaciòn y secreciòn La activaciòn de la PKCes esencial par que ocurra la agregaciòn y secreciòn

79 Receptores de trombina: GP Ib-V-IX, PAR 1 y PAR 4

80 EFECTORES INTRACELULARES El AA (presente en las membrana celulares) es el precursor de una flia heterogenea de compuestos con una importante funciòn moduladora El AA (presente en las membrana celulares) es el precursor de una flia heterogenea de compuestos con una importante funciòn moduladora La biosintesis de eicosanoides depende de la liberaciòn de AA no esterificado de las membranas fosfolipidicas como consecuencia de la activaciòn de la fosfolipasa A2 por diferentes agonistas. La biosintesis de eicosanoides depende de la liberaciòn de AA no esterificado de las membranas fosfolipidicas como consecuencia de la activaciòn de la fosfolipasa A2 por diferentes agonistas. El AA es transformado en intermediarios inestables como PGH2( por la COX),en varios hidroperoxidos 5,12, 15HETEs por las correspondientes LOX El AA es transformado en intermediarios inestables como PGH2( por la COX),en varios hidroperoxidos 5,12, 15HETEs por las correspondientes LOX

81 PGG 2 PGH2 TROMBOXANO A2/B2 PLC IP3 DAG Ca 2+ PKC CO TXasa TP Mecanismo de amplificación de señal: síntesis de TROMBOXANO A2

82 ESTIMULACIÓN DE LA SÍNTESIS Ac. Araquidónico Tromboxano A 2 Movilización del Ca intracitoplasmático Contracción de los trombocitos Prostaciclinas Inhibición de la agregación Vasodilatación Prostanglandinas Estimulo de la agregación Vasoconstricción

83

84 Hereditarias: Hereditarias: Telangiectasia Hemorrágica de Rendu-Osler Telangiectasia Hemorrágica de Rendu-Osler Síndrome de Ehlers-Danlos Síndrome de Ehlers-Danlos Adquiridas: Adquiridas: Inmunes: Púrpura de Schöenlein-Henoch Inmunes: Púrpura de Schöenlein-Henoch No Inmunes:Escorbuto No Inmunes:Escorbuto Púrpura Senil Enfermedad de Waldestrom Amiloidosis Púrpuras Angiopáticas

85 Hereditarias: Hereditarias: Síndrome TAR Síndrome TAR Síndrome de Bernard-Soulier (GP IbVIX) Síndrome de Bernard-Soulier (GP IbVIX) Trombastenia de Glanzman (GP IIb IIIa) Trombastenia de Glanzman (GP IIb IIIa) Enfermedad del Pool de Depósito Enfermedad del Pool de Depósito Adquiridas: Adquiridas: Inmunes: PTI – Trombocitopenia Inducida por Heparina Inmunes: PTI – Trombocitopenia Inducida por Heparina No Inmunes:Tratamiento antiagregante No Inmunes:Tratamiento antiagregante CID - Efecto dilucional en politransfundidos Plaquetas grises en circulación extracorpórea Aplasia Medular - Infecciones Púrpuras Trombocitopénicas y Trombocitopáticas

86 Hemorragias cutaneomucosas (Petequias - Equimosis )

87 Trombocitopenia Rto de plaquetas < 150x10 9 /LRto de plaquetas < 150x10 9 /L AUMENTO DE DESTRUCCIÓN, CONSUMO O SECUESTRO PERIFÉRICO PRODUCCIÓN DISMINUIDA Hipoplasia megacariocitica Trombocitopoyesis ineficaz ADQUIRIDAS Aplasia medular Hipoplasia QMT o RT Infiltración de MO Drogas Infecciones virales Déficit de vitB12 o fólico Sindromes mieloproliferativos Sindromes mielodisplasicos Hemoglobinuria paroxistica nocturna Alcohol Infección por HIV

88 Trombocitopenia Rto de plaquetas < 150x10 9 /L Rto de plaquetas < 150x10 9 /L Producción disminuida Hipoplasia megacariocitica Congénitas: Trombocitopenia amegacariocítica Sindrome TAR Sind Wiscott Aldrich Sind May Hegglin Sind Chediack Higashi Sind de plaquetas grises Sind de Bernard Soulier Sind de FAnconi Sind de Alport Epstein Adquiridas: Trombocitopenia ciclica

89 Trombocitopenia Rto de plaquetas < 150x10 9 /L Rto de plaquetas < 150x10 9 /L Producción disminuida Trombocitopoyesis ineficaz Déficit de vitB12 o fólico Sindromes mieloproliferativos Sindromes mielodisplasicos Hemoglobinuria paroxistica nocturna Alcohol Infección por HIV

90 Tipo de trombocitopenia Patologìa Mediada por Anticuerpos: Destrucciòn mediada por auto AC Destruccion mediada por aloAC Destrucciòn por vìa RES dependiente de fàmacos mediada por aloAC PTI,PTI secundaria (asociada a enfermedades linfoproliferativas,del colàgeno, HIV, MNI Trombocitopenia neonatal aloinmune, purpura postranfusiòn Purpura trombocitopènica inducida por quinina, quinidina,sulfamidas No inmune Activaciòn de plaquetas por via de la trombina o de citocinas Destrucciòn por hemofagocitosis Destrucciòn por mecanismos desconocidos CID,septicemia,pancreatitis Sindromes linfoproliferativos malignos, infecciones PTT,SHU

91 Mecanismo Púrpura trombocitopenica inmune NEJM,2002, mar 28;346(13) Autoanticuerpos antiplaquetarios Clearence acelerado por los macrófagos por unión fragmento Fc- receptor Disminución de la vida media plaquetaria PLAQUETOPENIA

92 PTI

93 Trombocitosis Rto de plaquetas > 400x10 9/ L Rto de plaquetas > 400x10 9/ L Trombocitemia primaria Trombocitemia reactiva Alteraciones del sistema hematopoyético Trombocitemia esencial Fisiológicas Regeneración sanguínea rápida Asplenia Enfermedades infecciosas e inflamatorias Neoplasias Traumatismo, cirugías, drogas

94 TROMBOCITOSIS I-Sìndromes Mieloproliferativos I-Sìndromes Mieloproliferativos II-Trombocitosis Secundaria : II-Trombocitosis Secundaria : Enfermedades malignas Enfermedades malignas Enfermedades Inflamatorias Enfermedades Inflamatorias Enfermedades del tejido conectivo Enfermedades del tejido conectivo Infecciones Infecciones Perdida aguda de sangre Perdida aguda de sangre Anemia Hemolìtica Anemia Hemolìtica Cirugìa Cirugìa Respuesta a fàrmacos Respuesta a fàrmacos Respuesta al ejercicio Respuesta al ejercicio Prematuridad Prematuridad Recuperaciòn de una trombocitopenia Recuperaciòn de una trombocitopenia

95

96 MEGATROMBOCITOS EN SMD

97 RECUENTO DE PLAQ Y MORFOLOGIA AL MICROSCOPIO OPTICO *Autoanalizadores hematologicos:VPM : FL ;PDW:15-19 Seudotrombocitopenias y Trombocitosis *Rcto inmunologico por CMF *Rcto por Microscopia : Camara y met Fonio *Morfologia:*Formaciòn de agregados *Anisocitosis *Anisocitosis *Alteraciones en los grànulos *Alteraciones en los grànulos

98 IMPEDANCIA Enfoque hidrodinámico Recuento de plaquetas

99

100 INDICES PLAQUETARIOS Los hacen los modernos autoanalizadores. Los hacen los modernos autoanalizadores. Plaquetocrito. Plaquetocrito. Volumen plaquetario medio. Volumen plaquetario medio. Anchura de distribución plaquetaria. Anchura de distribución plaquetaria.

101 ANALISIS DE LA FUNCIÒN PLAQUETAR Tiempo de Sangria : *Mètodo de Duke Tiempo de Sangria : *Mètodo de Duke *Mètodo de Ivy ; VN: 3min – 8 min *Mètodo de Ivy ; VN: 3min – 8 min Anormal: trombocitopenias< /L, enfermedad de vWF, dèficit de glucoproteinas, defectos en la agregaciòn plaquetarias trombocitopatìas adquiridas, fàrmacos Anormal: trombocitopenias< /L, enfermedad de vWF, dèficit de glucoproteinas, defectos en la agregaciòn plaquetarias trombocitopatìas adquiridas, fàrmacos

102 Tiempo de sangría TS: sensibilidad - especificidad - reproducibilidad sensibilidad - especificidad - reproducibilidad Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, barrido excesivo Afectado por: frío, ejercicio, ansiedad, presión del corte, dirección de la incisión, barrido excesivo

103 Alteraciones plaquetarias Evaluación Recuento plaquetario normal Tiempo de sangría prolongado ó normal Adhesividad plaquetaria disminuida Enfermedad de von Willebrand Estudio de trastornos plaquetarios cualitativos Congénitos ó adquiridos

104 ADHESIVIDAD PLAQUETA SUPERFICIE In Vivo : Borchgrevink (Acta Med Scand 1960, 168:157) In Vitro : Mann (colágeno) Hellem II (superficie de vidrio) Scand J Haemat 1970, 7: 37 vW

105 columna cp Sangre entera Columna: tubuladura de PVP 3mm diámetro, rellena con perlas de vidrio de 0.5mm diámetro, 1.3 g por columna. Bomba de flujo constante: velocidad 1ml/ 9seg. bomba sp EDTA 2% %Adh = 100- SP- CP SP ADHESIVIDAD: método de Hellen II VN > 27%

106 Métodos point of care Sangre entera (800 µL) 1 Comenzar el test 3 Insertar cassette 2 PFA-100

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108 Estudio de la función plaquetaria Estudio de Agregación y Secreción plaquetaria Bernard-Soulier Glanzmann Citometría de Flujo Alteraciones de la activación/secreción Estudio de gránulos Disminuido Déficit de pool de depósito Gránulos densos: Marcación con Mepacrina por Citometría de flujo Gránulos : Fibrinógeno, FvW, Fn intraplaquetarios Tromboxanos Síntesis Receptores Disminuido Síndrome de las plaquetas grises

109 TECNICAS BIOQUIMICAS FUNCIONALES MORFOLÒGICAS ESPECIFICAS *Agregometrìa : Tècnica Turbidimètrica :Consiste en medir la DO que existe entre un PRP y un PPPal adicionar los agentes agonistas. La respuesta de las plaquetas se puede dividir en 4 fases: Cambio de forma, agregaciòn, movilizaciòn y oxidaciòn del A.A y liberaciòn del contenido de los grànulos. Tècnica Turbidimètrica :Consiste en medir la DO que existe entre un PRP y un PPPal adicionar los agentes agonistas. La respuesta de las plaquetas se puede dividir en 4 fases: Cambio de forma, agregaciòn, movilizaciòn y oxidaciòn del A.A y liberaciòn del contenido de los grànulos. Agonistas :ADP y epinefrina :Curva bifàsica :1º Cambio de forma Agonistas :ADP y epinefrina :Curva bifàsica :1º Cambio de forma 2º)Ampliaciòn de la respuesta generada por las sustancias liberadas en la 1ºfase(ADP;TX) 2º)Ampliaciòn de la respuesta generada por las sustancias liberadas en la 1ºfase(ADP;TX) Colageno :simula la agregaciòn plq in vivo Colageno :simula la agregaciòn plq in vivo

110 Agregación plaquetaria in vitro IIHEMA-ANM Método óptico (Born, 1980) Método potenciométrico (Challen, 1982)

111

112 AGREGACION Agonistas panel de rutina: ADR: 10 uM ( adrenérgicos) Col: 1 ug /ml ó 8 ug/ml (GP VI, Ia-IIa) AA: 0.5 mM (receptor de Tx) ADP: 2.5 uM, 5.0 uM (P2Y 1, P2Y 12 ) Ristosetina: 1.2 mg/ml (Ib-V-IX), 0.4 mg/ml (vW tipo II) Agonistas especiales TRAP6 : PAR1, PAR4 U46619: análogo de TX Endoperóxidos cíclicos: actividad Tx sintaza Ionóforos (A23187): movilización de Calcio

113 agregación inhibición de la agregación tiempo (min) %T

114 AGREGACION

115 Interpretación de la agregación - Cualitativa (semicuantitativa) - Cuantitativa

116 Recuento de plaquetas: / mm3 (en cámara) Macroplaquetas (frotis)

117 * CMF: Permite analizar la estructura, composiciòn bioquimica y activaciòn Metodologia se basa en el doble marcaje de la muestra.Un anticuerpo unido a un fluorcromo sirve para seleccionar la poblaciòn plq.El 2º anticuerpo unido a otro fluorcromo sirve para marcar el antigeno problema Aplicaciones: Estudio de GP de membrana, actividad procoagulante y activaciòn plq(cambio en la conformaciòn de la GPIIbIIIa, expresiòn de Pselectina

118 CITOMETRIA DE FLUJO Gráfico de puntos de la dispersión frontal y lateral de una suspensión de plasma rico en plaquetas Plaquetas sin estimularPlaquetas estimuladas Histograma De fluorescencia

119 TOMA DE MUESTRA: 5 mL de sangre. ANTICOAGULANTE (1:10): citrato de sodio3.8%, EDTA 2%, PFA 1%? PANEL DE MONOCLONALES: ISOTIPO-FITC / PE CD42b ( Ib ), CD41 ( IIb ), CD61 ( IIIa ), CD29 ( Ia ), CD36 ( GPIV ) eventos CELL-QUEST IIHEMA-ANM MARCACION EN SUPERFICIE

120 TROMBOASTENIA DE GLAZMMAN MARCACION EN SUPERFICIE MM KG

121 Dispersión frontal- Tamaño (FSH) P: 202 Madre: 65 Control: 47 P P P CD 42-b (GP Ib) (IMF) P:25 Madre: 171 Control: 257 CD61 (GP IIIa) (IMF) P: 389 Madre: 176 Control: 167 Paciente Madre Sindrome de BERNARD SOULLIER IIHEMA-ANM

122 * METODOS ESPECIFICOS PARA EL ESTUDIO DE PLAQUETAS - Glucoproteinas de la membrana plaquetaria: Electroforesis en gel de poliacrilamida, tècnicas de ELISA,inmunoelectroforesis cruzada Electroforesis en gel de poliacrilamida, tècnicas de ELISA,inmunoelectroforesis cruzada -Actividad procoagulante(FP3):por metodo coagulomètricos o sustratos cromogènicos -Liberaciòn del contenido de los grànulos alfa: se evalua B tromboglobulina,FP4,PDGF - Estudio de activaciòn :Ca++por CMF o fluorometria

123 ACTIVACIÓN PLAQUETARIA DETERMINACIÓN EXPRESIÓN DE P-SELECTINA (CD62P) EXPRESIÓN DE P-SELECTINA (CD62P) GPIIbIIIa ACTIVADA (CD41CD61) GPIIbIIIa ACTIVADA (CD41CD61) SECRECIÓN (ATP) SECRECIÓN (ATP)

124 ACTIVACIÓN PLAQUETARIA DETERMINACIÓN

125 - expresión de marcadores de activación en la superficie de la plaqueta (ex vivo) CD62P P-selectina golll Condiciones analíticas de difícil estandarización: - anticoagulantes - tiempo de ensayo - controles negativos adecuados - expresión de resultados (% de eventos positivos, intensidad media de fluorescencia) - escasas referencias de CV intra e Inter ensayo IMF % positivos Marcadores de activación plaquetaria:

126 TECNICAS INMUNOHEMATOLOGICAS * Tecnicas de detecciòn de Ac antiplq: -Investigaciòn de AloAc antiplaq: -Investigaciòn de AloAc antiplaq: *IFI :permite la detecciòn de los Ac fijados a la membrana de unas plaq de control con la ayuda de una antiglobulina fluorescente, (MO o CMF) *IFI :permite la detecciòn de los Ac fijados a la membrana de unas plaq de control con la ayuda de una antiglobulina fluorescente, (MO o CMF) * ELISA:Se utiliza antiglobulina marcada con perox para detectar los Ac * ELISA:Se utiliza antiglobulina marcada con perox para detectar los Ac * MAIPA(inmobilizaciòn de Ag plq por Ac monoclonales especificos) Es mas sensibles que las anteriores * MAIPA(inmobilizaciòn de Ag plq por Ac monoclonales especificos) Es mas sensibles que las anteriores

127 - Investigaciòn de autoAc plaq - Prueba de IFD y IFI:consiste en evidenciar e auto Ac en la membrana de la plaq mediante una antiglobulina humana fluorescente -ELISA,MAIPA, PAICA(caracterizaciòn de IgG asociada a plaq) TECNICAS PARA LA TIPIFICACIÒN DE AG PLAQ -El analisis del genotipo HPA se realiza mediante tècnicas de biologia molecular

128 Paciente Control normal Negativo 3 IFM IgG 10 IFM IgG 34 IFM IgM 3 IFM IgM 31 IFM Negativo 3 IFM Inmunoglobulinas asociadas a superficie plaquetaria: detección por citometría de flujo

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131 ACIDO ACETIL SALICILICO Inactiva en forma irreversible la ciclooxigenasa plaquetaria y disminuye la formación de Tromboxano A 2 » Tpo Sangría: prolonga con variaciones » Agregación plaquetaria: inhibe DIPIRIDAMOL Estimula la adenilciclasa e inhibe la fosfodiesterasa Aumenta el AMP Cíclico » Tpo Sangría: no se modifica » Agregación plaquetaria: no se detectan modificaciones trabajando con PRP Drogas que inhiben la función plaquetaria

132 CILOSTASOL Inhiben la función plaquetaria actuando sobre los 2º mensajeros. Inhibe la fosfodiesterasa III, exclusiva de las plaquetas y la células musculares. Aumenta el AMPc y baja la concentración de Ca++ citosólico. » Tpo Sangría: lo modifica » Agregación plaquetaria: se inhibe respuesta con ADP CLOPIDOGREL Y TICLOPIDINA Son derivados de las Tienopiridinas. Inhiben la función plaquetaria interfiriendo con el receptor de ADP Inhiben unión FI-GPIIb-IIIa sin modificación estructural » Tpo Sangría: lo modifican » Agregación plaquetaria: se inhibe respuesta con ADP Drogas que inhiben la función plaquetaria

133 INHIBIDORES DE LA GPIIbIIIa Actúan inhibiendo la unión del FI a la GPIIbIIIa Anticuerpos monoclonales contra GPIIb IIIa: Abciximab (c7E3) Péptidos de secuencia RGD: Heptapéptido cíclico Integrelin. Secuencia Lys-Gly-Asp (RGD) del veneno de víbora barborina. Simuladores de la secuencia RGD: pequeñas moléculas semejantes a las secuencias RGD llamadas Desintegrinas. » Tpo Sangría: pueden prolongarlo » Agregación plaquetaria: pueden inhibir agreg. con ADP Drogas que inhiben la función plaquetaria


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