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P AOLA B ENEIT V ILLENA 14/ DIC /2010. Citogenética Convencional Estudio citogenético convencional de las neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética:

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Presentación del tema: "P AOLA B ENEIT V ILLENA 14/ DIC /2010. Citogenética Convencional Estudio citogenético convencional de las neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética:"— Transcripción de la presentación:

1 P AOLA B ENEIT V ILLENA 14/ DIC /2010

2 Citogenética Convencional Estudio citogenético convencional de las neoplasias hematológicas En SP y MO Citogenética: Estudio de los cromosomas de las células hematopoyéticas en su fase de máxima concentración (metafase) Cariotipo: Ordenación de los cromosomas en 22 parejas de cromosomas autosómicos y una pareja de cromosomas sexuales

3 Ventajas En un solo experimento, analizamos todo el genoma celular, con información de todos los cromosomas Bajo coste económico Disponibilidad Alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales Significación clínica establecida

4 Inconvenientes Requiere cultivo de tejido fresco Analiza células sólo en división Lenta en tumores sólidos (2 semanas), aunque en neos hematológicas, se puede en 24-72h Precisa personal experimentado Baja sensibilidad Poco poder de resolución en alteraciones cromosómicas complejas, microdelecciones, …

5 Muestras Médula Ósea extraída mediante punción esternal o de cresta ilíaca, en un tubo estéril de heparina sódica Sangre Periférica extraída en un tubo de 10ml de heparina sódica Biopsia ganglionar guardada en un tubo con medio de cultivo ¡I NTENTAR MÁXIMAS CONDICIONES DE ASEPSIA !

6 Siembra En primer lugar, se realiza la siembra de los cultivos en condiciones estériles en la cámara de flujo laminar Se siembran 0.5 ml en dos Falcons de cultivo estéril (preparados con 10ml de caldo de cultivo a -20ºC) Según dx de la muestra, se cultiva 24-72h, con o sin TPA

7 Orientación Diagnóstica Tipo de Muestra Tipo de Cultivo Mitógenos[ ] y tiempo de Colcemid SMDMÓ o SP24/48h 24h + MTX ____________ (0,1 g/ml) 30 SMPCMÓ o SP24/48h 24h + MTX ____________ (0,1 g/ml) 30 LAMMÓ o SP24/48h 24h + MTX ____________ (0,1 g/ml) 30 LALMÓ o SPDirecto/24h____________ (0,1 g/ml) 2 h SLPC/LNHSP o MÓ72hTPA (estimulación de línea B) PHA (estimulación de línea T) (0,15 g/ml) 2h SLPC/LNHGanglio/bazo/ exudado/ masa tumoral 24h: Sin estimulación celular 48/72h: Con mitógeno TPA/PHA (0,1 g/ml) 20 (sin estimular) (0,15 g/ml) 2h (estimulado) MMMÓ48/72h: Sin estimulación 120h: Con IL-4 (0,1 g/ml) 20

8 Sacrificio de los cultivos Añadir 0.1 ml del antimitótico Colcemid y se deja en estufa de CO 2 a 37ºC durante 30 las mieloblásticas (LAM, LMC, SMD, SMPC) 2º las linfoblásticas (SLPC, LNH) Pasamos el contenido a un tubo de centrífuga, y lo centrifugamos 10 a 1200 rpm Posteriormente, decantamos el sobrenadante, dejando el botón (pellet) y resuspendemos Choque Osmótico: 8 ml de ClK 0.075M gota a gota, agitando, y lo dejamos 30 al baño maría (37ºC)

9 Sacrificio de los cultivos Centrifugamos, decantamos, y se añaden 5ml del fijador Carnoy (metanol:ácido acético 3:1) agitando. 10 a temperatura ambiente Repetimos el paso anterior, dejando 30 en nevera Centrifugamos, decantamos, y añadimos 1ml de Carnoy Resuspendemos y pasamos a un tubo NUP

10 Portaobjetos Porta previamente guardado a 4ºC con metanol. Secamos, cubrimos con fijador (Carnoy) y mientras decantamos se tiran 1 ó 2 gotas de la preparación. Se flamea y se deja secar Miramos en microscopio invertido para ver la densidad celular y la extensión de los cromosomas Se hacen 4 extensiones de cada cultivo 24h en estufa de desecación a 60ºC, para envejecer

11 Portaobjetos Para la tinción Solución de tripsina 12 segundos Lavamos con PBS 2 segundos Giemsa al 5% 5 minutos Lavar y mirar al microscopio Se cubren Metafer® para seleccionar metafases

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17 Leucemias agudas MomentoCultivoCariotipoFISH LAMDx2x24h + ADN + ARN + Criopreserv. SíCYTOCELL Evolución2x24hSíConsultar Pre/Post Tx2x24hSíConsultar LAM INFANTILDx2x24hSí7, 8, MLL LAM (día sig.)Dx24h + 48hSíCYTOCELL LAPDx1x24h + 1x48hSíPML/RARα Recaída1x24h + 1x48hSíPML/RARα Evolución1x24h + 1x48hConsultar LALDx - Adultos2x24hSíBCR/ABL + MLL Dx - Niños2x24hSíBCR/ABL + MLL + TEL/AML1 + E2A Evolución2x24hSíConsultar Pre/Post Tx2x24hConsultar

18 Del(5q) PML/RARα

19 Delección p53 AML1/ETO

20 MLL Del(7q)

21 MYH11/CBFβ Del(20q)

22 SMD y SMPCMomentoCultivoCariotipoFISH SMD *Dx2x24hSí5q- Evolución2x24hSíConsultar Pre/Post Tx2x24hSíConsultar SMPCDx2x24hSíBCR-ABL (SP) Evolución2x24hSíConsultar LMCDx2x24hSíBCR-ABL (SP) Evolución2x24hSíBCR-ABL (SP) LMMCDx2x24h + ADN + ARNSíPDGFR α y β* + BCR-ABL Evolución2x24hSíNo

23 SLPCMomentoCultivoCariotipoFISH SLPC-BDx2x72h + TPANoFISH LLC + IgH LLCDx2x72h + TPANoFISH LLC + IgH SLPC-TDx2x72h + PHANoFISH LLC + IgH LINFOMASMomentoCultivoCariotipoFISH MantoDx2x72h + TPANoBCL-1 FolicularDx2x72h + TPANoBCL-2 No definidoDx2x72h + PHANoIgH HodkingNo OTROS Moment o CultivoCariotipoFISH Anemia AplásicaDx2x24hSí7q- Fragilidad Cromósomica Dx2x72h + PHA 2x72h + DPB 2x72h + 10 MTC 2x72h + 40 MTC SíNo

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25 FISH Complemento de la técnica de citogenética Hibridación in situ: Marcar o identificar una secuencia de ADN con una sonda específica que reconoce dicha secuencia Sonda: Secuencia de ADN marcadas con un fluorocromo, específicas, que reconocen una determinada secuencia del genoma

26 FISH Alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales tanto en células que no entran en división (interfase) como en células en división (metafase) La mayoría de los dx hematológicos se asocian a una alteración citogenética determinada Confirmación de dx clínicos, caracterizar grupos pronósticos y realizar monitorización de EMR Valoración del quimerismo hematopoyético tras el trasplante de médula ósea alogénico cuando existe discrepancia de sexo entre donante y receptor

27 FISH Menor S que otras técnicas moleculares Identificación de anomalías cromosómicas crípticas o difíciles de detectar para la citogenética convencional Por el hecho de permitir identificar mutaciones en interfase, simplifica el procesamiento de la muestra al no requerirse cultivo Técnica sencilla y rápida En determinados casos, en 4-5h se puede tener un dx

28 FISH Puede aplicarse en células depositadas en un portaobjetos de microscopia (frotis convencional, impronta de tejido, citocentrifugación…) hasta cortes de tejido incluidos en parafina Se ha usado esta técnica para muestras en parafina almacenadas durante años (hasta 12) a tª ambiente Técnica de elección (por delante de la PCR) para búsqueda de translocaciones que involucran a genes promiscuos, y para delecciones en MM, LLC…

29 Variantes Variantes tecnológicas Hibridación genómica comparada (CGH) Cariotipo espectral (SKY-FISH) Multiplex FISH (M-FISH) Aplicaciones crecientes

30 Variantes (M-FISH y SKY-FISH) Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisión único y diferenciable de lo demás Se pinta a cada cromosoma de un color Los cromosomas anómalos aparecerán no uniformes Útil en neos hematológicas Caracteriza correctamente translocaciones complejas y crípticas

31 Ventajas (M-FISH y SKY-FISH) Permiten analizar todo el genoma Enorme poder de resolución Identificación de segmentos cromosómicos no identificados (gran avance en el conocimiento de los genes implicados en patologías)

32 Inconvenientes (M-FISH y SKY- FISH) Requieren cultivo de tejido fresco Analizan sólo células en división Personal experimentado tanto en la realización como en la interpretación Sensibilidad similar al cariotipo, aunque la información sea más concluyente No detectan delecciones, inversiones o duplicaciones dentro de un cromosoma Elevado coste económico Equipo informático sofisticado

33 Muestras Preparaciones de citogenética convencional tras cultivo de médula ósea, sangre periférica, ganglio u otros tejidos La muestra obtenida de estos cultivos se conserva en solución Carnoy También es aplicable a extensiones en fresco de muestras biológicas

34 Preparación – Día 1 Extensiones: Eppendorf (donde se ha guardado el material de citogenética convencional) del congelador a -20ºC, se centrifuga, se decanta, y se resuspende con fijador nuevo Una gota en un porta previamente tratado con metanol y secar a la llama o con plancha a ºC Observar extensiones en microscopio invertido a x10 aumentos para ver la distribución de núcleos y el secado Guardar a Tª ambiente 24h Si la muestra es urgente, se puede hibridar en el mismo día, dejando al menos 1h en temperatura ambiente

35 Hibridación - Día 2 En oscuridad 7 µl de tampón 1 µl de sonda 2 µl de agua destilada Se colocan en el porta, tapar con un cubre y colocar en el Hybrite e incubar según cada sonda (24h normalmente) Tª ambiente Eppendorf estéril

36 Lavado y contratinción - Día 3 En oscuridad Lavado post-hibridación Retiramos cubre, lavamos 2 en un baño a 74ºC con una solución de lavado Posteriomente, lavamos 1 en una solución de lavado a distinta concentración y a temperatura ambiente Contratinción Poner 10 µl de DAPI II y cubrir Poner a -20ºC en una caja oscura, envueltas en papel de aluminio, como mínimo 30-1º

37 Microscopio de Fluorescencia Sondas centroméricas: Mínimo de 200 núcleos, con los núcleos con 1, 2, 3 ó 4 señales de hibridación Trisomía: Si >5% de células con 3 señales Monosomía: Si >15% con 1 señal Sondas de locus específicos: Valorar mínimo de 100 núcleos o de 20 metafases Valorable si >5% de células alteradas

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