Buenos Aires 2 de noviembre 2009

Presentación del tema: "Buenos Aires 2 de noviembre 2009"— Transcripción de la presentación:

1 Buenos Aires 2 de noviembre 2009
Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein CONICET- Fundación Pablo Cassará Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009

2 Molecular Farming Se define como una estrategia alternativa de producir moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales) Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad. La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año. Mercado actual: 50 mil millones de U$. Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.

3 Ventajas Bioseguridad Maquinara de síntesis proteica eucarionte
Producción en condiciones controladas (sistemas confinados)

4 Aspectos críticos Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para resolverlo (humanización de glicoproteínas). Tiempo: optimización del esquema de producción DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio). Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.

5 Sistemas de producción
Planta a campo Sistemas confinados (cultivos in vitro, invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)

6 Cultivos in vitro Callos Cultivos de órganos (raíces, tallos)
Frascos agitados Bioreactores Suspensiones celulares

7 Raíces transformadas Rápido crecimiento Estado de organización
Estabilidad de producción The main problem in cultivation of hairy roots in these bioreactors is limitation of oxygen mass transfer, which often results in reduced growth and metabolite production. Conventional bioreactors, which are generally used for cell suspension cultures cannot be used for hairy roots as they form root clumps which resist the percolation of oxygen

8 Biorreactores para el cultivo de raíces
Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor) Adición de nutrientes Bomba Salida de aire Aire Inóculo Reservorio Malla de inmovilización Bomba de aire Rotámetro peristáltica Bomba Generador de niebla Cámara de cultivo Controlador On Off Intensidad Filtro de aire Condensador de niebla In this regard, various modifications were attempted such as a stirred tank bioreactor in which the impellers were separated by a mesh from roots to reduce the shear; and a segmented bubble column bioreactor with multiple spargers for better aeration. In all the bioreactors studied, the conductivity decreased gradually with culture time (Fig. 5). From an initial level of 5.4 mS, the decrease was gradual and reached levels of 3.6, 3.6, 3.9, and 4mS in acoustic mist, nutrient sprinkle, bubble column, and shake flask, respectively. This decrease can be attributed to the intake of nutrients by growing hairy roots leading to a decrease in number of ions, which in turn decreases the conductivity. The conductivity decrease was correlated with an increase in biomass. Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

9 Suspensiones celulares
Frascos agitados Pequeños volúmenes Conocimiento del sistema Estudios para escalado

10 Bioreactores Volumen 1 -3000 litros Producción en gran escala
Modelo acorde al sistema y escala de producción

11 Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales

12 Consideraciones para el diseño
Crecimiento y demanda de oxígeno Estado de agregación y propiedades reológicas Sensibilidad a las fuerzas de corte Formación de espuma/ pared celular

13 Crecimiento y demanda de oxígeno
Tiempos de duplicación altos ( hs) BY-2: 12 hs NT-1, Xanthi: hs Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, células animales: x 10-9) A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno. Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m3, 20% saturación. KLa en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: ; células animales: ), rango restringido. Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), vvm (tanques agitados), altos niveles tóxicos.

14 Agregados-reología Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc. Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).

15 Sensibilidad a las fuerzas de corte
Tamaño celular (largo: µm , diámetro: µm) mayor a bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: 5-10 µm), células animales ( diámetro: µm) Alto volumen de vacuolas (90% volumen total) Pared celular rígida, no- flexible. Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar) Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación. Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados

16 Espuma/pared celular En la fase de crecimiento exponencial
Exacerbada durante la fase estacionaria Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxígeno: caída de la productividad Crecimiento en pared, impeler, sensores. Taponamiento de filtros de aire. Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.

17 Estrategias para productos intracelulares
Aumento de la tasa de crecimiento Aumento de la concentración de biomasa Fase exponencial más extensa Batch-/batch alimentado a alta densidad celular Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesión a superficies

18 Estrategias para productos extracelulares
Mayor tasa de crecimiento Mayor concentración de biomasa Fase exponencial más extensa Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de alta densidad celular Recuperación de producto in situ Mayor estabilidad de proteínas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.

19 Agitador de paletas planas o Rushton Agitador de paletas inclinadas
Tanques agitados Agitador de paletas planas o Rushton Pros Flexibilidad Altos coeficientes de transferencia de masa Homogéneos Aplicable a cultivos de alta densidad Permite trabajar en GMP Cons Sistema de mezclado (shear stress) Costos Generación de calor Riesgos de contaminación en válvulas Agitador de paletas inclinadas

20 Neumáticos: burbujeo Pros Cons Fácil de escalar Bajos costos
Bajos riesgos de contaminación Sin generación decalor Bajo shear stress Cons Transferencia de oxígeno pobre Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad Formación de espuma a alta aireación

21 Neumáticos: airlift Pros Cons Direccionamiento del burbujeo
Buena transferencia de oxígeno Menor shear stress, sin generación de calor Menores tiempos de mezclado Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulación de fluidos Cons Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad Formación de espuma a alta aireación

22 Wave Pros Cons Shear stress Transferencia de oxigeno
Costos operacionales Cons Escalado Transferencia de calor Estrategias operacionales avanzadas

23 De membrana Pros Cons Remoción de productos extracelulares
Bajo shear stress Bajos costos operacionales Cons Escalado Oxigenación Baja transferencia de calor Monitoreo on- line Esta unidad de cultivo desechable fue diseñada para superar estas limitaciones dividiendo el biorreactor en dos cámaras, una cámara del medio y una cámara de células. Gracias a eso, pueden garantizarse condiciones de cultivo óptimas también como sistema estático. Una membrana semipermeable (10 kDa MWCO – peso molecular de corte) entre las cámaras permite la difusión de moléculas pequeñas de una cámara a la otra. Así se garantiza, por una parte, un suministro constante de substancias nutritivas en la cámara de células y, por otra parte, una eliminación simultánea de los metabolitos tóxicos. Las moléculas de alto peso molecular secretadas por las células proliferantes se retienen y concentran en la cámara de células. Como ambas cámaras tiene acceso separadamente, los pasos de trabajo generales como el suministro del medio y la cosecha celular pueden realizarse según las necesidades individuales. Además, por debajo de la cámara de células se encuentra una membrana permeable a gases, la que garantiza un suministro de oxígeno óptimo y un intercambio de dióxido de carbono del cultivo celular. El diseño de este bioreactor de membrana desechable permite la conservación óptima de las células bajo condiciones de cultivo similares a las “in vivo”. Con la tecnología de dos cámaras de CELLine, las limitaciones de substancias nutritivas y de oxígeno son problemas del pasado. En este biorreactor pueden alcanzarse densidades celulares dentro de la cámara de células 100 veces superiores a las que se logran con otras técnicas de cultivo estáticas convencionales.

24 Algunos ejemplos comerciales
Producto Sistema Compañía Vacunas aviares Suspensiones celulares de tabaco (4-40 mg l-1) Dow AgroSciences glucocerebrosidasa Suspensiones celulares de zanahoria (Fase III) Protalix Biotherapeutics paclitaxel Suspensiones celulares de Taxus Phyton Biotech IPLEX (macasermin rinfabato ) Suspensiones celulares (2 g l-1) Phyton Biotech+ Insmed

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27 Eco-Pod Reactor temporario para algas. Producción de biocombustibles.

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29 Muchas gracias por su atención