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Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez Instituto de Ciencia y.

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Presentación del tema: "Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez Instituto de Ciencia y."— Transcripción de la presentación:

1 Aplicaciones de la propagación masiva de plantas. Molecular Farming Dra. María Alejandra Alvarez Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. César Milstein CONICET- Fundación Pablo Cassará Jornada de Actualización en Propagación Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009

2 Molecular Farming Se define como una estrategia alternativa de producir moléculas (proteínas, ácidos grasos) de aplicación terapéutica o industrial en organismos transgénicos (animales, vegetales) Los motores primarios de este desarrollo son economía, eficiencia y seguridad. La demanda de USA de proteínas recombinantes se expande en un 13% por año. Mercado actual : 50 mil millones de U$. Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.

3 Ventajas Bioseguridad Maquinara de síntesis proteica eucarionte Producción en condiciones controladas (sistemas confinados)

4 Aspectos críticos Glicosilación: no siempre debe ser idéntica, hay estrategias para resolverlo (humanización de glicoproteínas). Tiempo: optimización del esquema de producción DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificación, usando fusión a oleosinas o con cultivos in vitro (secreción al medio). Rendimiento: Al menos 1% de proteína total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimización a distintos niveles: ingeniería genética, actividad proteolítica, etc.

5 Sistemas de producción Planta a campo Sistemas confinados (cultivos in vitro, invernáculos, piletas, hidroponia, etc.)

6 Cultivos in vitro Callos Cultivos de órganos (raíces, tallos) – Frascos agitados – Bioreactores Suspensiones celulares – Frascos agitados – Bioreactores

7 Raíces transformadas Rápido crecimiento Estado de organización Estabilidad de producción

8 Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor) Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces Biorreactores para el cultivo de raíces Bomba de aire Rotámetro Bomba peristáltica Generador de niebla Cámara de cultivo Controlador OnOff Intensidad Filtro de aire Condensador de niebla Adición de nutrientes Bomba Salida de aire Aire Inóculo Reservorio Malla de inmovilización Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

9 Suspensiones celulares Frascos agitados – Pequeños volúmenes – Conocimiento del sistema – Estudios para escalado

10 Bioreactores Volumen litros Producción en gran escala Modelo acorde al sistema y escala de producción

11 Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales

12 Consideraciones para el diseño Crecimiento y demanda de oxígeno Estado de agregación y propiedades reológicas Sensibilidad a las fuerzas de corte Formación de espuma/ pared celular

13 Crecimiento y demanda de oxígeno Tiempos de duplicación altos ( hs) – BY-2: 12 hs – NT-1, Xanthi: hs Tasa de captación de oxígeno (OUR): 5-10 mmol- O 2 /l h (microorganismos: 10-90, células animales: x ) A alta densidad celular, productividad volumétrica limitada por la transferencia de oxígeno. Concentración de oxígeno disuelto crítica: 1.3 – 1.6 g m 3, 20% saturación. K L a en bioreactor: 10 – 50 hs -1 (microorganismos: ; células animales: ), rango restringido. Aireación: 0.5 – 1 vvm (neumáticos), vvm (tanques agitados), altos niveles tóxicos.

14 Agregados-reología Distribución de tamaños según la especie, inóculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc. Gradiente de nutrientes y oxígeno en el interior de los agregados Reología: varía a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).

15 Sensibilidad a las fuerzas de corte Tamaño celular (largo: µm, diámetro: µm) mayor a bacterias (diámetro < 1 µm), hongos (largo <100 µm, diámetro: µm), células animales ( diámetro: µm) Alto volumen de vacuolas (90% volumen total) Pared celular rígida, no- flexible. Alta sensibilidad durante la fase tardía de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamaño celular, elevado tamaño vacuolar) Influye sobre: viabilidad, liberación al medio de compuestos intracelulares, cambios metabólicos, cambios morfológicos, patrones de agregación. Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados

16 Espuma/pared celular En la fase de crecimiento exponencial Exacerbada durante la fase estacionaria Las células entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxígeno: caída de la productividad Crecimiento en pared, impeler, sensores. Taponamiento de filtros de aire. Estrategias posibles: menor velocidad de agitación y aireación, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeración de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecánico de espuma.

17 Estrategias para productos intracelulares Aumento de la tasa de crecimiento Aumento de la concentración de biomasa Fase exponencial más extensa Batch-/batch alimentado a alta densidad celular Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesión a superficies

18 Estrategias para productos extracelulares Mayor tasa de crecimiento Mayor concentración de biomasa Fase exponencial más extensa Batch, batch alimentado, perfusión en cultivos de alta densidad celular Recuperación de producto in situ Mayor estabilidad de proteínas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.

19 Tanques agitados Pros – Flexibilidad – Altos coeficientes de transferencia de masa – Homogéneos – Aplicable a cultivos de alta densidad – Permite trabajar en GMP Cons – Sistema de mezclado (shear stress) – Costos – Generación de calor – Riesgos de contaminación en válvulas Agitador de paletas planas o Rushton Agitador de paletas inclinadas

20 Neumáticos: burbujeo Pros – Fácil de escalar – Bajos costos – Bajos riesgos de contaminación – Sin generación decalor – Bajo shear stress Cons – Transferencia de oxígeno pobre – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación

21 Neumáticos: airlift Pros – Direccionamiento del burbujeo – Buena transferencia de oxígeno – Menor shear stress, sin generación de calor – Menores tiempos de mezclado – Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulación de fluidos Cons – Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad – Formación de espuma a alta aireación

22 Wave Pros – Shear stress – Transferencia de oxigeno – Costos operacionales Cons – Escalado – Transferencia de calor – Estrategias operacionales avanzadas

23 De membrana Pros – Remoción de productos extracelulares – Bajo shear stress – Bajos costos operacionales Cons – Escalado – Oxigenación – Baja transferencia de calor – Monitoreo on- line

24 Algunos ejemplos comerciales ProductoSistemaCompañía Vacunas aviaresSuspensiones celulares de tabaco (4-40 mg l -1 ) Dow AgroSciences glucocerebrosidasaSuspensiones celulares de zanahoria (Fase III) Protalix Biotherapeutics paclitaxelSuspensiones celulares de Taxus Phyton Biotech IPLEX (macasermin rinfabato ) Suspensiones celulares (2 g l -1 ) Phyton Biotech+ Insmed

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27 Eco-Pod Reactor temporario para algas. Producción de biocombustibles.

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29 Muchas gracias por su atención


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