TALLER DE APLICACIONES PRÁCTIAS 1

Presentación del tema: "TALLER DE APLICACIONES PRÁCTIAS 1"— Transcripción de la presentación:

1 TALLER DE APLICACIONES PRÁCTIAS 1
Dra. María Isabel Fonseca

2 Desnaturalización – renaturalización del DNA

3 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Es objetivo de la PCR obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Se llama "cadena", porque los productos de la primera reacción se convierten en sustratos de la siguiente, y así sucesivamente. Kary Banks Mullis Premio novel de Química en 1993

4 Componentes necesarios para realizar PCR
ADN target: que contiene la secuencia que se desea amplificar Dos de cebadores (S y AS) que delimitan la secuencia que se va a amplificar dNTPs sustratos para la síntesis ADN polimerasa termoestable que cataliza la reacción Iones Mg++ Cofactor de la enzima Sn buffer mantiene el pH y la fuerza iónica en la reacción necesario para una adecuada actividad del enzima agua

5 Controles utilizados en la PCR
+ -

6 Etapas del proceso

7 El equipo utilizado para realizar
la PCR Tubos con PCR TERMOCICLADOR

8 PCR Desnaturalización Templado Elongación 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

9 * *

10 El equipo utilizado para realizar
la PCR ANÁLISIS DE PCR Visualización Electroforesis - +

11 Marcadores Moleculares

12 MARCADORES MOLECULARES
LOS MARCADORES MOLECULARES SE DEFINEN COMO TODO O CUALQUIER FENOTIPO MOLECULAR ORIUNDO DE UN GEN QUE SE EXPRESA, COMO EN EL CASO DE LAS ISOENZIMAS, O DE UN SEGMENTO ESPECÍFICO DE ADN (CORRESPONDIENTE A REGIONES QUE SE EXPRESAN O NO DEL GENOMA). PUEDEN SER MARCADORES MOLECULARES LAS PROTEÍNAS (Ag E ISOENZIMAS) Y EL ADN (REGIONES CODIFICANTES O NO CODIFICANTES)

13 MARCADORES MOLECULARES
DNA RNA transcripción Proteína traducción Secuencias o moléculas de DNA Secuencias o moléculas de RNA Secuencias o moléculas de Proteínas MARCADORES MOLECULARES

14 Marcadores moleculares
Secuencias conocidas Fáciles de detectar y seguir en la población Codificantes o no codificantes Secuencias conservadas Secuencias polimórficas

15 Secuencias polimórficas
Variabilidad genómica poblacional Análisis de diversidad Identificación de individuos El grado de polimorfismo permite distinguir la utilidad del marcador

16 Polimorfismo (mutaciones con frecuencia mayor al 1%)
- Varios alelos por locus. ATGCCGCGCTT ATGCCATGCTT ATGCTGCGCTT

17 Polimorfismos Génico No génico Grupos del sistema ABO Isoenzimas
No ejercen presión selectiva Minisatélites y microsatélites SNP no génicos

18 Secuencias relativamente conservadas
Grado de conservación y disponibilidad determina la utilidad (ej. Especies, variedades, formas especiales) Regiones STS para mapear genomas Regiones ETS para mapear transcriptomas Familias génicas y genes homólogos

19 STS (Sitios etiquetados por la secuencia)
Marcadores moleculares: secuencias conservadas STS (Sitios etiquetados por la secuencia) DNA ETS (secuencias etiquetadas expresadas) mRNA cDNA

20 Marcadores moleculares:
secuencias polimorficas SNP (polimorfismo de simple nucleótido) STR (microsatélites) VNTR (minisatélites) RFLP (sitios de cortes de enzimas de restricción) RAPD (fragmentos amplificados al azar)

21 MARCADORES MOLECULARES (MM)
¿Secuencias conocidas o desconocidas? Variabilidad - polimorfismo Factibilidad técnica de reconocerla

22 ¿Qué encontramos en un segmento de cromosoma humano?
Brown, T. A. Genomes. 2nd ed. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd;

23 Secuencias repetidas en tándem
Unidad de repetición: pb Bloque 100 a u Minisatélites ATGCGTGGTCTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAACTAGGCTCTAATGCCTGAATTCGG Unidad de repetición: 2-6 pb Bloque <50 u Microsatélites ATGCGAATGTGGTCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTTCGGCGTTTGAAGT

24 VNTR: minisatélites (variación del número de repeticiones)
  Enzima de restricción Alelo A sonda sonda Alelo B sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA cortos AB corto y 1 largo BB largos

25 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
EcoRI Escherichia coli HindIII Hemophilus influenzae ......G-A-A-T-T-C...... ......C-T-T-A-A-G...... A-A-T-T-C...... G...... ......G ......C-T-T-A-A ......A-A-G-C-T-T...... ......T-T-C-G-A-A...... A-G-C-T-T...... A...... ......A ......T-T-C-G-A-A Sma I Serratia marcescens ......C-C-C-G-G-G...... ......G-G-G-C-C-C...... G-G-G...... C-C-C...... ......C-C-C ......G-G-G

26 ESTRUCTURA de STR

27 DISEÑO DE CEBADORES

28 Microsatélites + Amplificación: PCR Alelo A Alelo B genotipos posibles
AA: 2 copias de 4 repeticiones = 4 repeticiones AB: 4 repeticiones + 5 repeticiones AC: 4 repeticiones + 6 repeticiones AD: 4 repeticiones + 7 repeticiones BB: 5 repeticiones BC: 5 repeticiones + 6 repeticiones BD: 5 repeticiones + 7 repeticiones CC: 6 repeticiones CD: 6 repeticiones + 7 repeticiones DD: 7 repeticiones Electroforesis AA AB AC AD BC BD CD + Alelo C Alelo D 7 6 5 4

29 10 min para Resolver

30 SNP: Polimorfismos de simple nucleótido
Haplotipo 1: TTCGCGTGTCCGTAATGCTGATGA Haplotipo 2: TTCGCGTGTCCGGAATGCTGCTGA Haplotipo 3: TTCGCATGTCCGTAATGCTGCTGA G/A T/G A/C CTAGGCTCTAATGCCTGAA CTAGGCTTTAATGCCTGAA

31 RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de
restricción     Enzima de restricción sonda sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA cortos AB corto y 1 largo BB largos

32 RFLP: Variación en sitios de corte de enzimas de
restricción     Enzima de restricción sonda sonda 3 genotipos posibles AA AB BB Electroforesis + hibridación con sonda (Southern blot) + AA cortos AB corto y 1 largo BB largos

33 RFLP: Ejemplo (detección de HbS)
Porción de DNA del cromosoma exón intrón A exón 2 ...    Alelo A bA-globina NORMAL CCTTAGG CCTGAGG CCTGAGG dianas de Mst II Alelo A bS-globina FALCIFORME CCTTAGG CCTGAGG CCTGAGG dianas de Mst II 1,2 kb ,2 kb Digestión con Mst II AA AS SS Sonda 1 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb AA AS SS Sonda 2 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb

34 PCR-RFLP: análisis de sitios de restricción
Fragmento del gen X exón intrón A exón 2  Mst II Alelo A CCTGAGG Alelo B CCTTAGG 1,2 kb ,2 kb Digestión con Mst II AA AB BB 1,4 kb 1,2 kb 0,2 kb

35 15 min para Resolver El polimorfismo A>G en el codón 655 del gen que codifica para la región transmenbrana del receptor HER2 provoca un cambio aminoacídico de Ile>Val que impulsaría la actividad tirosina quinasa del receptor de manera constitutiva. Como HER2 es el recepetor del factor de crecimiento, su actividad constitutiva implicaría que envié señales al nucleo activando genes involucrados en la proliferación celular. Las células con este polimorfismo crecen descontroladamente generando tumores que pueden derivar en un cáncer epitelial u otro dependiendo de donde se produce el crecimiento descontrolado. Producto de PCR: 300 pb En sitio de reconocimiento para la enzima se encuentra G originado un fragmento de 100 y otro de 200 pb. Esquematice todos los posibles resultados que obtendría al realizar la digestión con la enzima de restricción definiendo todos los genotipos posibles.

36 Marcadores para genomas desconocidos
Cuando no se disponen de datos genómicos. Asociación fortuita con fenotipos, pero de base genómica. Identificación de especies, variedades, grupos poblacionales acorde con el grado de polimorfismo

37

38 RAPD

39 Amplificación y análisis del rDNA

40 Marcadores de expresión: mRNA

41 Aplicaciones: análisis filogenético selección asistida por marcador
pruebas de paternidad y trazabilidad de los alimentos Estudios de linfomas, sarcomas y otros tumores. Estudios de genes supresores de tumores y oncogenes. Agentes infecciosos Estudios de identidad etc…

42 …en conclusión Los marcadores moleculares constituyen una herramienta de la Biología Molecular que permiten el análisis del genoma a través de diferentes estrategias.

43 Enlaces que se utilizaron en el diseño
Modern Genetic Analysis. Griffiths, Anthony J.F.; Gelbart, William M.; Miller, Jeffrey H.; Lewontin, Richard C. New York: W. H. Freeman & Co.; c1999. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith; Watson, James D. New York and London: Garland Publishing; c1994. Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. New York: W. H. Freeman & Co.; c1999. Human Molecular Genetics 2. 2nd ed. Strachan, Tom and Read, Andrew P. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 1999. Genomes. 2nd ed. Brown, T. A. Oxford, UK: BIOS Scientific Publishers Ltd; 2002